內(nèi)源性MRI鐵蛋白重鏈報(bào)告基因的體內(nèi)外成像.pdf

1、磁共振(MRI)報(bào)告基因在示蹤基因的表達(dá)有著無創(chuàng)、實(shí)時(shí)、空間分辨力高等優(yōu)勢(shì),特別是在監(jiān)測(cè)基因治療、評(píng)價(jià)細(xì)胞分化、干細(xì)胞示蹤、評(píng)估微環(huán)境中的一些特定的代謝物活性等方面有著很大的應(yīng)用前景。目前的MRI報(bào)告主要包括1)以酶為基礎(chǔ)的報(bào)告基因,如:β2-半乳糖核苷酶等；2)以受體為基礎(chǔ)的報(bào)告基因,其表達(dá)和特異的配體結(jié)合,可以引起MRI信號(hào)的改變；3)以金屬蛋白為基礎(chǔ)的報(bào)告基因,如:酪氨酸激酶,轉(zhuǎn)鐵蛋白受體等。上述報(bào)告基因的MRI的成像都需要加入外

2、源性的對(duì)比劑,這些物質(zhì)克服生物屏障,從血液、非特異組織中的清除是當(dāng)前MRI報(bào)告基因成像所面臨的巨大挑戰(zhàn)。
　　 鐵蛋白是一類普遍存在于動(dòng)、植物和微生物體內(nèi),可以與鐵特異性結(jié)合的生物大分子。一般每分子鐵蛋白結(jié)合約4000 個(gè)鐵離子,形成一種超順磁性鐵蛋白,引起MRI的信號(hào)的改變。大量體內(nèi)外研究表明鐵蛋白的表達(dá)可以縮短 MRI的T2時(shí)間弛豫。由于鐵蛋白基報(bào)告基因不依賴外源性的對(duì)比劑,所以有很大的優(yōu)勢(shì)和廣闊的發(fā)展前景。本文通過構(gòu)建小鼠

3、鐵蛋白重鏈質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞,通過體內(nèi)外的MRI成像,探討鐵蛋白作為一種新型內(nèi)源性MRI報(bào)告基因的可行性。
　　 第一部分 小鼠鐵蛋白重鏈基因質(zhì)粒構(gòu)建及其轉(zhuǎn)染C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞
　　 目的:應(yīng)用 pcDNA3.1(-)質(zhì)粒載體系統(tǒng)構(gòu)建攜帶小鼠鐵蛋白重鏈全基因質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞,使其高表達(dá),探索鐵蛋白基因作為一種新型內(nèi)源性磁共振分子影像報(bào)告基因的可行性。
　　 方法:從來源于小鼠肌肉的mRNA,根據(jù)Ge

4、nbank 中鐵蛋白序列設(shè)計(jì)引物,并在引物的5’端分別引入一對(duì)含有限制性內(nèi)切酶NotⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR),擴(kuò)增出鐵蛋白重鏈全基因(Fth)片斷。通過限制性內(nèi)切酶 NotⅠ和BamH Ⅰ酶切和T4連接酶的作用,將鐵蛋白重鏈全基因插入到載體 pcDNA3.1(-)中,構(gòu)建鐵蛋白重鏈全基因質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-Fth。構(gòu)建后經(jīng)雙酶切、測(cè)序等鑒定重組質(zhì)粒。酶切鑒定后,將重組質(zhì)粒通過脂質(zhì)體介導(dǎo),轉(zhuǎn)染C6大

5、鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞。并通過免疫組化方式鑒定鐵蛋白重鏈基因在C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況及分布。
　　 結(jié)果:重組質(zhì)粒經(jīng)NotⅠ和BamH Ⅰ酶雙酶切成5.4Kb和588bp兩個(gè)片段,單酶切成約6Kb片段,表明成功構(gòu)建質(zhì)粒 pcDNA3.1(-)-Fth,并經(jīng)測(cè)序結(jié)果證明編碼框正確。細(xì)胞免疫組化的分析得到鐵蛋白重鏈基因在大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)獲得表達(dá),表達(dá)主要在細(xì)胞漿內(nèi)。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建小鼠鐵蛋白重鏈質(zhì)粒,并在大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)

6、胞內(nèi)表達(dá),為進(jìn)一步探討鐵蛋白基因作為一種新型內(nèi)源性磁共振分子影像報(bào)告基因在細(xì)胞示蹤和基因顯像中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分 小鼠鐵蛋白重鏈基因的體內(nèi)、外磁共振成像
　　 目的:應(yīng)用鐵蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的大鼠膠質(zhì)瘤C6 細(xì)胞,行體內(nèi)、外的MRI成像,旨在探討其作為一種新型MRI內(nèi)源性報(bào)告基因的可行性及顯像特點(diǎn)。方法:將1.5×109 鐵蛋白重鏈基因轉(zhuǎn)染成功的大鼠膠質(zhì)瘤C6 細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染鐵蛋白的大鼠膠質(zhì)瘤C6 制成細(xì)胞懸液

7、,行體外細(xì)胞群的T2-MAP和T2*-MAP的MRI掃描,在T2值及T2*偽彩圖上測(cè)量靠近中央位置的不同體素的T2值及T2*值,比較兩細(xì)胞的T2、T2*值的差異性,統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。并通過普魯士藍(lán)實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞內(nèi)的鐵。
　　 SD 大鼠,體重 180～200g,雌雄不限,腹腔注射蔗糖鐵 50mg/kg,每三天注射一次,連續(xù)注射三周,高鐵模型的SD 大鼠構(gòu)建成功。
　　 將處于對(duì)數(shù)生長期的兩細(xì)胞種植于高鐵模型

8、的SD 大鼠(n=8)兩后肢皮下,左側(cè)后肢種植C6細(xì)胞,而右側(cè)后肢種植 C6-Fth 細(xì)胞,腫瘤生長至直徑約0.8～1.0cm,行荷瘤 SD 大鼠的MRI T2WI 掃描,腫瘤的中心位于表面線圈的中心線上,分析比較同一只大鼠的兩后肢的腫瘤在 T2WI 上的信號(hào)強(qiáng)度(SI腫瘤)與臨近等距離肌肉的信號(hào)(SI 肌肉)的比值(SI’)的差異性,統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用兩獨(dú)立樣本的t 檢驗(yàn)。通過對(duì)腫瘤組織常規(guī)病理切片的普魯士藍(lán)實(shí)驗(yàn)顯示腫瘤組織內(nèi)的鐵。

9、>　　 結(jié)果:應(yīng)用 T2-MAP 及 T2*-MAP 序列,MRI掃描C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞及 C6-Fth膠質(zhì)瘤細(xì)胞,兩種細(xì)胞的T2(t=-13.273,P<0.001)及 T2*(t=-3.284,P<0.05)值之間,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)高鐵荷瘤動(dòng)物的體內(nèi)掃描,C6 及 C6-Fth腫瘤在 T2WI 上的信號(hào)強(qiáng)度(t=-5.292,p<0.001)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞爬片和腫瘤組織切片的普魯士藍(lán)實(shí)驗(yàn)均證實(shí) C6-Fth 細(xì)胞及 C6