鹽酸法舒地爾對體外培養(yǎng)大鼠神經(jīng)干細胞分化的影響.pdf

1、背景
　　 傳統(tǒng)觀念認為,神經(jīng)細胞是一種終末細胞,缺乏再生能力,神經(jīng)細胞的產(chǎn)生僅限于胚胎和出生后的短暫時期內(nèi),當中樞神經(jīng)神經(jīng)系統(tǒng)因缺血、創(chuàng)傷、變性等疾病造成神經(jīng)細胞損傷后,神經(jīng)細胞很難建立新的突觸聯(lián)系,以至損傷后神經(jīng)功能難于恢復。近來研究表明,無論是在胚胎期還是在成年期,哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)均含有自我更新和多向分化潛能的神經(jīng)干細胞,神經(jīng)干細胞替代治療為神經(jīng)系統(tǒng)損傷、變性疾病的患者帶來了希望。但是目前尚無法對神經(jīng)干細胞的增殖、分

2、化與遷移進行有效控制,使其到達損傷區(qū)域,定向分化為特定的神經(jīng)細胞亞型,而且損傷部位周圍抑制因子的存在,阻止神經(jīng)干細胞向神經(jīng)細胞方向分化,促使其更多的向神經(jīng)膠質(zhì)細胞方向分化,形成膠質(zhì)瘢痕,影響神經(jīng)功能的修復。因此神經(jīng)干細胞的分化、增殖和遷移的機制是當今研究的熱點之一。RhoA是細胞骨架肌動蛋白的重要調(diào)節(jié)分子,Rho激酶傳導通路對細胞的分裂粘附、細胞分化遷移細、胞骨架調(diào)整、肌肉細胞收縮、腫瘤細胞侵潤等活動具有重要的調(diào)節(jié)作用。近來研究表明多種

3、神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展與Rho激酶信號通路的異常激活密切相關,抑制Rho激酶活性可有效預防和治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病,Rho激酶抑制劑也成為神經(jīng)系統(tǒng)新藥研究的靶點之一。鹽酸法舒地爾(六氫-1-(5-異喹啉基磺?；?-1H-1,4-二氮環(huán)庚烷,Fasudil,又名HA1077)是臨床上常用的RhoA激酶抑制劑,廣泛應用于腦血管病治療。本研究旨在觀察鹽酸法舒地爾對體外培養(yǎng)大鼠神經(jīng)干細胞分化的影響,是否可誘導神經(jīng)干細胞向神經(jīng)細胞定向分化,這對于研究神

4、經(jīng)干細胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷和變性疾病具有重要的意義。
　　 目的
　　 1.分離和培養(yǎng)神經(jīng)干細胞。
　　 2.觀察鹽酸法舒地爾對體外培養(yǎng)神經(jīng)干細胞分化的影響。
　　 方法：
　　 1.以新生24h內(nèi)的Wistar大鼠為實驗動物,采用懸浮培養(yǎng)的方法從新生大鼠腦組織中提取神經(jīng)干細胞,并進行傳代培養(yǎng)和干細胞分化實驗,采用免疫熒光法行神經(jīng)干細胞標記蛋白Nestin、神經(jīng)細胞標記蛋白NSE和星形膠質(zhì)細胞標

5、記蛋白GFAP染色,鑒定神經(jīng)干細胞及其自然貼壁分化后細胞表達的表面抗原。
　　 2.取培養(yǎng)第三代的神經(jīng)干細胞克隆,分別加入終濃度為50μmol/L,100μmol/L和200μmol/L的鹽酸法舒地爾為實驗組,不加入鹽酸法舒地爾的為對照組,干預30min后,然后更換神經(jīng)干細胞分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),倒置顯微鏡下觀察神經(jīng)干細胞分化后的細胞形態(tài)。
　　 3.采用免疫化學染色,觀察分化后細胞的NSE、GFAP表達情況,雙盲法計算各

6、組中陽性細胞比例,并采用流式細胞儀檢測各組中NSE陽性細胞比例。
　　 4.采用AO、EB染色法和LDH活性測定的方法,檢測神經(jīng)干細胞分化后細胞的存活率。
　　 結果：
　　 1.從新生大鼠大腦分離培養(yǎng)的細胞具有自我更新和分化能力,神經(jīng)球免疫化學染色Nestin陽性,其分化的細胞可以表達神經(jīng)細胞標記物NSE、星形膠質(zhì)細胞標記物GFAP。
　　 2.倒置顯微鏡下觀察,與對照組相比,鹽酸法舒地爾組分化出更多的

7、神經(jīng)元樣細胞,且實驗組免疫組化染色為NSE陽性細胞計數(shù)明顯高于對照組,其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 3.流式細胞儀檢測各組中NSE陽性細胞的比例發(fā)現(xiàn),實驗組較對照組分化出更多的NSE陽性細胞,且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。雖然隨著鹽酸法舒地爾濃度的增高,神經(jīng)球分化為神經(jīng)細胞的數(shù)目具有增多趨勢,但各組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 4.AO、EB染色:倒置顯微鏡下觀察鹽酸法舒地爾組大部分細

8、胞形態(tài)飽滿,細胞質(zhì)呈綠色,核染色為亮綠色,核形態(tài)規(guī)則,為圓形或橢圓形,僅有少量細胞核呈桔紅色；而對照組胞核紅染細胞數(shù)目較實驗組明顯增多；LDH活性檢測證明,神經(jīng)干細胞分化從第2d開始,對照組LDH活性較實驗組明顯增高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 結論：
　　 1.本研究成功分離出神經(jīng)干細胞,并在體外擴增、傳代,誘導分化后形成神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞,二者免疫熒光染色分別呈NSE和GFAP陽性。