大鼠骨髓基質細胞在溫敏型殼聚糖水凝膠中的生長觀察.pdf

1、目的：組織工程的常用方法是，將種子細胞種植于一種生物相容性良好并可被人體逐漸降解吸收的生物材料上進行擴增，形成細胞/生物材料結構物后回植體內修復受損組織。此時生物材料支架為細胞提供生存所需的三維空間，對細胞的有序構筑起接觸、引導及支架作用，使細胞能在預先設計的三維形狀支架上生長。骨髓基質細胞(MSCs)在體內及體外具有向神經(jīng)細胞分化的潛能，其具有來源廣泛、易于培養(yǎng)和自體移植不引起排斥反應、不涉及倫理問題等優(yōu)點，是構建組織工程的理想種子細

2、胞來源。為尋找理想的組織相容物，本實驗觀察MSCs在殼聚糖/β-磷酸甘油鈉(C/GP)凝膠中的存活和生長，有望為微創(chuàng)方式修復腦損傷摸索一種新的可注射性組織工程MSCs，為應用自體干細胞移植尋找較合適的可注射性載體提供實驗依據(jù)。 方法：1.取SD大鼠(體重50-60g)，麻醉處死后無菌條件下取雙側股、脛骨的骨髓，用貼壁培養(yǎng)法分離出MSCs，進行培養(yǎng)，并傳代擴增以純化MSCs，并連續(xù)觀察細胞形態(tài)及生長特性。 2. 室溫狀態(tài)下

3、用吸管將β-甘油磷酸鈉溶液緩慢滴入殼聚糖溶液中，邊滴加邊混勻，按照(9-1)：1梯度體積比配置成C/GP復合溶液，分別測混合液的PH值及37℃條件下的凝固時間(以凝膠在容器內倒置90°不流動、不變形為凝膠形成的標準)，選擇最適混合比。 3. 取傳3代的MSCs，以5.0×10<'4>/ml密度，接種于C/GP(體積比3∶2)混合溶液中，加入96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每孑乙加0.09ml的細胞-C/GP復合物，置37℃孵箱10 min

4、形成凝膠后，每孔加入完全培養(yǎng)液0.1ml，每日換液。隔日在倒置顯微鏡下觀察MSCs三維培養(yǎng)。 4. 制備單細胞懸液加完全培養(yǎng)基，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔20μl細胞懸液加C/GP復合物10μl，設為實驗組；每孔取20μl細胞懸液加10μl完全培養(yǎng)基，設為細胞對照組；每孔取10μl C/GP復合物加完全培養(yǎng)基20μl，設為C/GP對照組。從第2天起，24h后每組取3孔細胞用酶標儀測OD值，連續(xù)7d，繪制生長曲線分別。對兩組的OD值

5、作t檢驗，進行統(tǒng)計學分析 結果：1.分離出的MSCs呈圓形，約72h后絕大多數(shù)細胞已貼壁，細胞形態(tài)為梭形，多角形，約7～10天可達80％融合，此時細胞呈長梭形，傳代細胞較原代細胞成長快，約3～7天基本鋪滿瓶底。 2. 在室溫時，C/GP溶液呈半透明狀態(tài)，具有流動性：在升溫至37℃后，C/GP溶液變成白色不透明固體狀，失去了流動性。溫度的上升造成系統(tǒng)的溶膠/凝膠轉變。而隨著殼聚糖與β-甘油磷酸鈉的體積比的變化，C/GP溶液

6、的PH值及37℃凝固時間亦不同(見附表2)。 3. 接種于C/GP復合物24h后見細胞成球狀，未見明顯梭形及多角形細胞，48h內生長速度較慢，72h后可見梭形，多角形細胞，細胞數(shù)量明顯增多。 4. 通過繪制MSCs生長曲線，可得出兩條“S”形曲線，實驗組的細胞潛伏適應期為第1個24h，第2～3個24h為對數(shù)生長期，5天后細胞增殖減慢，6天后細胞基本停止生長。而細胞對照組的細胞潛伏適應期為第1～2個24h，對數(shù)生長期推后至

7、3～5個24h，1周后細胞基本停止生長。經(jīng)過統(tǒng)計學分析，認為實驗組和對照組的OD值無差異，MSCs在C/GP凝膠(體積比3∶2)中可良好存活、增殖。 結論：1. MSCs在體外培養(yǎng)條件下具有很強的增殖能力，生長特性穩(wěn)定。 2. 殼聚糖/β-甘油磷酸鈉混合物在室溫狀態(tài)下為液態(tài)，調整不同體積比37℃凝固時間可有差別，為溫敏型殼聚糖水凝膠。 3. MSCs在C/GP凝膠(體積比3∶2)中可良好存活、增殖，C/GP凝膠(