Mdm2抑制物治療乳腺癌及成人急性髓細(xì)胞性白血病的作用機(jī)制的研究.pdf

1、TP53(編碼p53蛋白)是研究得最多的抑癌基因,具有維護(hù)基因組穩(wěn)定性及嚴(yán)密調(diào)控細(xì)胞生長的功能。p53蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子通過與特定的DNA序列結(jié)合,轉(zhuǎn)錄激活下游基因。Mdm2基因是受p53蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控的下游基因之一,p53激活Mdm2,后者編碼的蛋白通過與p53蛋白的特異性結(jié)合,抑制p53的功能。Mdm2蛋白通過其泛素蛋白連接酶的作用,使p53蛋白發(fā)生泛素化,并促進(jìn)其被蛋白酶體降解。Mdm2蛋白正是通過這樣一個“自調(diào)節(jié)負(fù)反饋環(huán)”對細(xì)胞內(nèi)p

2、53蛋白的合理水平進(jìn)行精細(xì)的調(diào)控。p53激活的經(jīng)典模型如下:攜帶野生型p53(wt-p53)蛋白的腫瘤細(xì)胞遭受DNA損傷后,p53蛋白發(fā)生磷酸化,其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,與Mdm2蛋白的結(jié)合被打破,p53的穩(wěn)定性增加；p53進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與特定的DNA序列結(jié)合,轉(zhuǎn)錄激活下游基因。p53下游基因編碼的蛋白中,有導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯的CDKN1A(p21),有促進(jìn)調(diào)亡發(fā)生的Bcl-2蛋白家族成員,如Bax、Puma、Noxa,等等。p53蛋白正是通

3、過轉(zhuǎn)錄激活這些基因參與決定細(xì)胞的命運(yùn)。
　　 超過50％的人類惡性腫瘤與p53蛋白發(fā)生異常有關(guān),其中最常見的異常是p53的DNA結(jié)合區(qū)發(fā)生氨基酸的突變(由TP53基因的點(diǎn)突變造成),使p53蛋白無法與特定的DNA序列結(jié)合,無法轉(zhuǎn)錄激活下游基因。而在攜帶wt-p53的惡性腫瘤中,Mdm2基因常發(fā)生擴(kuò)增或產(chǎn)物過表達(dá),使p53蛋白被快速降解而無法在核內(nèi)達(dá)到足夠的水平,相比之下,突變的p53(mut-p53)蛋白不激活Mdm2的表達(dá),因

4、而穩(wěn)定性增加。因此,打破p53-Mdm2的蛋白.蛋白相互作用從而穩(wěn)定wt-p53蛋白,恢復(fù)其抑癌功能,成為了腫瘤小分子靶向治療開發(fā)的新熱點(diǎn)。
　　 本研究所采用的基于p53-Mdm2多肽一蛋白復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)結(jié)合計算機(jī)三維藥效模型而設(shè)計并合成的小分子Mdm2抑制物(MI-219),具有競爭性結(jié)合Mdm2蛋白,游離wt-p53并使其蛋白水平上調(diào),能夠誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯及腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　 乳腺癌在實(shí)體瘤中TP53基因突變率

5、較低,而成人急性髓細(xì)胞性白血病(acutemyelogenous leukemia,AML)中TP53基因突變率僅約10％,故成為本研究選用的疾病模型。
　　 材料與方法：
　　 以Mdm2抑制物處理乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7等)、良性細(xì)胞系(HMEC等)、19個AML細(xì)胞系以及從109例AML病人外周血或骨髓提純的分化障礙的白血病細(xì)胞(經(jīng)細(xì)胞離心涂片固定染色并經(jīng)鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察確定純度為90％以上),采用流式細(xì)胞儀檢測

6、細(xì)胞周期停滯以及調(diào)亡的發(fā)生；采用WST assay檢測細(xì)胞生長抑制情況；采用Western blotting檢測p53,p21,Mdm2,MdmX蛋白的表達(dá)；采用針對MdmX的siRNA以及Cisplatin等化療藥物下調(diào)MdmX蛋白；采用Q-PCR檢測AML臨床標(biāo)本p53,Mdm2,MdmX的mRNA水平；對AML細(xì)胞株及提純后的AML病人白血病細(xì)胞的TP53外顯子5-9、NPM1基因exon12、以及Flt3-ITD基因突變進(jìn)行測序

7、；采用SNP6.0 assay以及相關(guān)一系列分析軟件對病變(白血病細(xì)胞DNA)及正常(對應(yīng)的頰粘膜細(xì)胞DNA)染色體17p進(jìn)行比較；采用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(5-azacytadine,5-aza)以及組蛋白去乙?；敢种苿?Tricostatin A,TSA)研究表觀遺傳修飾對p53基因失表達(dá)的作用。
　　 臨床資料的搜集包括每例病人的一般資料、詳細(xì)的既往病史及治療史、染色體核型及細(xì)胞遺傳學(xué)分析、病理分期、確診時外周血及骨髓

8、中白血病細(xì)胞的百分比、白血病細(xì)胞表面抗原屬性等(資料為University of Michigan Hospital所有)。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分 MI-219抑制物通過有效上調(diào)wt-p53蛋白水平而有效誘導(dǎo)攜帶wt-p53的乳腺癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期停滯以及細(xì)胞凋亡,但對正常細(xì)胞無毒性。
　　 攜帶wt-p53蛋白的乳腺癌細(xì)胞在MI-219處理后發(fā)生細(xì)胞生長抑制、G1期細(xì)胞周期停滯、以及細(xì)胞凋亡,而攜帶mu

9、t-p53蛋白的乳腺癌細(xì)胞對MI-219沒有反應(yīng)。M1-219能夠上調(diào)wt-p53的蛋白水平,而不改變mut-p53的蛋白水平。攜帶wt-p53的MCF-7/Her-2(穩(wěn)定表達(dá)Her-2)細(xì)胞與其對照MCF-7/vec(空白質(zhì)粒)對MI-219處理的反應(yīng)沒有顯著差異。用siRNA下調(diào)MdmX蛋白的水平,或用化療藥物處理乳腺癌細(xì)胞以達(dá)到下調(diào)MdmX蛋白的目的,這兩種手段均對MI-219誘導(dǎo)的調(diào)亡起協(xié)同作用。MI-219能夠誘導(dǎo)良性細(xì)胞發(fā)

10、生細(xì)胞周期停滯,但不發(fā)生細(xì)胞凋亡。
　　 第二部分多種分子機(jī)制共同決定成人急性髓細(xì)胞性白血病對Mdm2抑制物的敏感或者抗藥。
　　 在攜帶wt-p53的AML病人當(dāng)中,有大約30％病人對Mdm2抑制物發(fā)生抗藥。17號染色體短臂(17p)的中性雜和性缺失在AML病人中很常見,大多數(shù)合并TP53基因突變或不表達(dá)。TP53基因突變不能涵蓋該AML群體中所有對Mdm2抑制物抗藥的病例。至少在本研究當(dāng)中,wt-p53攜帶者中,p5

11、3蛋白低表達(dá)或失表達(dá)不能被DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑或組蛋白去乙?；敢种苿┠孓D(zhuǎn)。樣本中Mdm2或MdmX蛋白的基礎(chǔ)表達(dá)水平與樣本對Mdm2抑制物的IC50沒有關(guān)聯(lián)。在本研究當(dāng)中,完整功能的wt-p53以及Flt3-ITD同時存在的病例對Mdm2抑制物尤為敏感。
　　 結(jié)論：
　　 第一部分:
　　 1.與正常細(xì)胞相比,乳腺癌細(xì)胞高表達(dá)Mdm2蛋白。
　　 2.Mdm2抑制物有效誘導(dǎo)攜帶wt-p53的乳腺癌細(xì)

12、胞發(fā)生凋亡,但對正常細(xì)胞無毒性,將很有可能成為針對攜帶wt-p53蛋白的惡性腫瘤的新型靶向治療藥物。
　　 3.Mdm2抑制物能夠有效誘導(dǎo)高表達(dá)Her2/neu的乳腺癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。
　　 4.下調(diào)MdmX蛋白對Mdm2抑制物所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡起協(xié)同作用。
　　 5.Mdm2抑制物與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合應(yīng)用能夠協(xié)同殺死攜帶wt-p53的乳腺癌細(xì)胞。
　　 第二部分:
　　 1.對TP53突變的病人不

13、應(yīng)給予Mdm2抑制物。
　　 2.不能一味地認(rèn)為wt-p53的病例100％對Mdm2抑制物敏感
　　 3.聯(lián)合應(yīng)用多種基因異常檢測手段檢測以TP53基因異常為主的遺傳標(biāo)記物才能最大程度區(qū)分出有可能對Mdm2抑制物抵抗的病例。
　　 4.Flt3-ITD突變存在下的絕大部分AML對Mdm2抑制物極其敏感,但目前尚缺乏具備敏感性和特異性的檢測方法以有效地識別對Mdm2抑制物抵抗的病例。
　　 5.目前臨床實(shí)踐