LPS刺激人臍靜脈內皮細胞免疫相關分子的表達變化及其機制研究.pdf

1、背景：血管內皮細胞(VEC)是機體中一類重要的細胞群體，具有分泌、合成、代謝和免疫等多種功能。它在體內廣泛分布，形成血液和組織之間的界面，不僅與血管張力、血管通透性和凝血密切相關，而且通過產生促炎癥細胞因子及與循環(huán)白細胞相互作用在炎癥反應中起關鍵作用。正常情況下的VEC處于靜息狀態(tài)，當受到外源性或內源性的刺激后活化，活化后VEC的結構和功能將發(fā)生改變。大量研究已證明，內毒素(LPS)是刺激內皮細胞活化的最重要的炎性因素之一。LPS可通過

2、直接和間接兩種途徑激活內皮細胞，通過與內皮細胞上的相應受體結合介導激活信號的直接途徑是近年來研究的重點。目前在內皮細胞上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并鑒定多種LPS受體，其中，TOLL樣受體家族4(TLR4)的研究近年來備受關注，已取得諸多進展。 內皮細胞被LPS激活后，首先發(fā)生細胞退縮、表達P選擇素和Von.Willerbrand因子，進而表達多種粘附分子，分泌細胞因子、組織因子等，通過募集白細胞，激活炎性細胞介導炎癥反應。內皮細胞是非專職抗原提

3、呈細胞(APC)，與專職APC相比，未活化或活化的內皮細胞所表達的免疫相關分子的類型及其功能都有其特殊性。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，內皮細胞無論活化與否都不表達B7-1和B7-2，但卻表達或活化誘導表達MHCⅡ分子及共刺激分子CD40/CD40L、CD58/CD2、PD-1/PD-L1、ICOS/B7RP-1等介導和調節(jié)特異性免疫應答。目前，有關內皮細胞表面免疫相關功能分子的鑒定及其功能的研究，已經(jīng)成為內皮細胞免疫調節(jié)功能研究的重點和熱點問題。

4、 目的：1.觀察LPS刺激活化人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)后，與免疫相關的細胞膜分子和細胞因子表達及變化情況。 2.探討LPS激活內皮細胞后對免疫應答可能的影響和機制。 方法：1.內皮細胞的分離培養(yǎng)及鑒定：足月健康新生兒臍帶6小時內胰蛋白酶消化分離HUVEC，接種于M199培養(yǎng)液內，根據(jù)細胞生長狀態(tài)、形態(tài)特征及檢測膜上特異性抗原(Ⅷ因子)對HUVEC進行鑒定。 2.觀察LPS致HUVEC分泌細胞因子的變化：

5、用終濃度0，50，100，1000ng/ml刺激培養(yǎng)細胞24小時后收集培養(yǎng)上清，用ELISA法檢測細胞因子IL-6、IL-8、TNF-α的水平。 3.檢測HUVEC上共刺激分子mRNA的表達：提取有、無LPS刺激的HUVEC的總RNA，以β-actin為內參照，用RT-PCR方法檢測TLR4、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-DC、LIGHT、HVEM、TR6、LTβR、HLA-DR、CD80、CD86、OX

6、40L、OX40mRNA的表達情況。Bandscan軟件進行圖像分析，以目的基因擴增產物電泳條帶的總灰度值與β-actin電泳條帶總灰度值之比表示目的基因mRNA表達的強度。 4.觀測CD40、ICAM-1、CD137分子蛋白的表達：收集LPS刺激組和未刺激組的細胞，應用流式細胞分析技術觀測CD40、ICAM-1、CD137分子蛋白水平的表達變化。 5.檢測阻斷TLR4后HUVEC細胞因子分泌的改變：應用特異性抗體封閉T

7、LR4后，收集有、無LPS刺激及阻斷后刺激的三組細胞的培養(yǎng)上清，用ELISA法檢測IL-6、IL-8、TNF-α的水平。 6.檢測阻斷TLR4后對共刺激分子mRNA表達的影響：應用特異性抗體阻斷TLR4與LPS的相互作用，收集有、無LPS刺激及阻斷后刺激的三組細胞RNA，以人β-actin為標準，梯度稀釋繪制標準曲線，進行實時熒光定量PCR檢測3中各膜分子mRNA表達的變化 7.應用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計學分析。

8、 結果：1.HUVEC分離培養(yǎng)及鑒定：體外培養(yǎng)的HUVEC生長狀態(tài)及活性良好，形態(tài)典型，Ⅷ因子相關抗原陽性，細胞純度＞95％。符合實驗要求。 2.RT-PCR和實時熒光定量RT-PCR檢測細胞膜免疫相關分子mRNA表達的結果顯示：未經(jīng)刺激的HUVEC表達TLR4、B7-H2、B7-H3、TR6、LTβR，并在LPS刺激后表達上調；B7-DC、HUVEM雖呈組成性表達，但在LPS刺激后未見變化；OX40L、B7-H1、B7-

9、H4僅在內皮細胞上為誘導表達；而CD80、CD86、LIGHT、OX40、HLA-DR無論刺激與否均未表達。 3.流式細胞儀檢測證實：未經(jīng)刺激的HUVEC低表達CD137及CD40、ICAM-1，LPS刺激后其表達量明顯提高。 4.ELISA檢測結果發(fā)現(xiàn)：正常HUVEC在未激活狀態(tài)下就能夠分泌少量IL-6、IL-8、TNF-α；LPS刺激HUVEC可明顯提高細胞因子的分泌量，且表現(xiàn)出劑量依賴效應，但TNF-α的產量遠遠低

10、于前二者。 5.用阻斷性TLR4抗體阻斷LPS與TLR4的結合后，發(fā)現(xiàn)細胞因子IL-6、IL-8和TNF-α的產生和分泌顯著降低，證實LPS刺激內皮細胞產生細胞因子主要與TLR4途徑相關；對LPS上調表達的B7-H2、B7-H3、TR6、LTβR、CD137、CD40分子及LPS誘導的B7-H1、B7-H4分子的表達，阻斷TLR4后均有不同程度的表達下調，而對不受LPS刺激影響的B7-DC、HVEM分子，其表達水平亦無影響。

11、 結論：1.采用RT-PCR、real-timePCR及流式細胞分析技術，較全面地觀察了未刺激的和LPS刺激活化的人臍靜脈內皮細胞免疫相關膜分子的表達情況。在國內外首次從mRNA水平發(fā)現(xiàn)B7-H3、B7-DC在HUVEC上組成性表達，B7-H4為誘導表達；并首次從mRNA和蛋白水平發(fā)現(xiàn)HUVEC能組成性表達CD137分子，且表達水平可被LPS上調。 2.通過對未刺激的和LPS刺激活化的人臍靜脈內皮細胞免疫相關膜分子的表達情況

12、的觀測，結果提示內皮細胞作為非專職APC，活化后的內皮細胞能以MHC-Ⅱ類分子限制方式提呈抗原，由于缺乏CD80、CD86的共刺激活性，對初始T細胞活化無影響；但其可以借助ICAM-1、CD40、OX40等作用增強與T細胞的黏附，促進T細胞增殖分化，同時通過與B7家族(包括B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-DC)、CD40、OX40L等分子產生共刺激信號，在LIGHT與其三個受體相互作用的輔助下活化靜止的記憶性T細胞

13、及調節(jié)已活化的T細胞；通過這些分子中占多數(shù)的負性調節(jié)因子(如：B7-H1、B7-DC、B7-H3、B7-H4、LTβR)可能對免疫應答進行負調控。 3.通過ELISA發(fā)現(xiàn)內皮細胞IL-6、IL-8、TNF-α的產生能被LPS顯著提高，并表現(xiàn)出劑量依賴方式。提示內皮細胞借助這些細胞因子募集、趨化白細胞、促進T細胞分化增殖，形成體內的細胞因子反饋調節(jié)網(wǎng)絡，介導炎癥反應、調節(jié)免疫應答。 4.用阻斷性TLR4抗體阻斷TLR4與L