重組人凝血因子Ⅷ(rhFⅧ)表達載體構(gòu)建及在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中高效表達.pdf

1、目的:凝血因子Ⅷ(FⅧ)是一個血漿大分子糖蛋白，在血液凝固中起重要作用。FⅧ的缺失可導(dǎo)致甲型血友病。目前國內(nèi)甲型血友病的防治主要依賴于反復(fù)給予病人由人血漿制備的FⅧ。然而，臨床上不僅人FⅧ來源有限，而且病人還可能通過輸入人FⅧ時而導(dǎo)致血液傳播性疾病如肝炎、HIV等的發(fā)生。因此，應(yīng)用重組人凝血因子Ⅷ(rhFⅧ)治療血友病則可避免上述問題。本課題旨在構(gòu)建rhFⅧ重組表達載體，通過瞬時轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-細胞獲得高效表達的rhFⅧ，從而為大

2、規(guī)模生產(chǎn)rhFⅧ提供實驗理論依據(jù)和基礎(chǔ)。
　　材料和方法:pTriEx-4 Neo載體是一多用途表達載體，它可分別用于細菌、昆蟲及哺乳動物細胞的外源性基因的高效表達，它不僅帶有篩選基因Neo用于穩(wěn)定細胞系的建立，而其攜帶的His.Tag、S.Tag、HSV.Tag等標簽便于對目的蛋白的分離純化。CHO細胞是一常用的外源蛋白表達的宿主細胞，它既可以貼壁生長，具有較高的耐受剪切力和滲透壓的能力，又可進行懸浮培養(yǎng)或無血清培養(yǎng)有利于大規(guī)模

3、生產(chǎn)。CHO-dhfr-是二氫葉酸還原酶(DHFR)缺陷的細胞系，當成功轉(zhuǎn)染含有DHFR的表達載體后，細胞可在不含鳥嘌呤及胸腺嘧啶的培養(yǎng)基中生長。此外，利用甲氨蝶呤(MTX)加壓篩選，可以得到穩(wěn)定表達外源蛋白的細胞系。
　　我們首先將人FⅧ全長序列，IRES和DHFR克隆至pTriEx-4 Neo載體，然后采用聚乙烯亞胺(PEI)融合法將該載體轉(zhuǎn)染CHO-dhff-細胞進行瞬時高效表達，最后利用rhFⅧ特異性抗體(ELISA試劑盒

4、)檢測細胞rhFⅧ的表達水平。
　　結(jié)果與結(jié)論:我們成功地構(gòu)建了重組質(zhì)粒pTriEx-4-FⅧ-IRES-DHFR高效表達載體，該載體采用PEI導(dǎo)入CHO-dhfr-細胞后實現(xiàn)了外源蛋白(FⅧ)的瞬時表達，且經(jīng)ELISA法檢測到rhFⅧ的表達水平為2.5ng/ml。
　　本實驗成功建立了一種由CHO-dhfr-細胞瞬時表達rhFⅧ的方法，后續(xù)實驗將試圖建立穩(wěn)定表達rhFⅧ的CHO-dhfr-細胞株，從而為大規(guī)模制備rhFⅧ奠