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1、目的:構(gòu)建重組人成骨細(xì)胞刺激因子(recombinant human osteoblast-stimulating factor, rhOSF-1)高效畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng),獲得rhOSF-1,為進(jìn)一步研究該蛋白的在骨代謝性疾病中的作用打下基礎(chǔ)。
方法:(1)全基因人工合成的方法合成重組人osf-1基因,5’末端加酶切位點(diǎn)EcoRI,3’末端加終止子taa和酶切位點(diǎn)NotI。目的基因合成后連入pMD19克隆載體中,構(gòu)建為pMD
2、19/osf-1重組質(zhì)粒,測(cè)序。(2)用EcoRI和Not1分別酶切pMD19/hrosf-1重組質(zhì)粒和表達(dá)載體pPIC9k,1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證,切膠回收目的片段,使用DNA Ligation Kit將重組人osf-1基因與表達(dá)載體酶切片段連接,構(gòu)建為重組質(zhì)粒pPIC9k/hrosf-1,篩選陽性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定。用SacI單酶切得到線性化重組質(zhì)粒pPIC9k/osf-1及線性化空白對(duì)照pPIC9k,分別電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母菌GS115
3、中。轉(zhuǎn)化液涂布RDB平板,30℃培養(yǎng)72小時(shí),挑取單克隆在MD平板上篩選His+表型,然后采用不同濃度梯度YPD-G418平板篩選多拷貝酵母菌重組子,挑取陽性克隆在MD及MM平板上篩選Mut+表型。提取酵母菌基因組DNA做模板,使用PCR的方法進(jìn)行鑒定。(3)將篩選的陽性克隆菌株在YPD培養(yǎng)基中,30℃200rpm進(jìn)行種培養(yǎng);當(dāng)OD600達(dá)2~4時(shí),將種菌液接種BMGY培養(yǎng)液中,25℃及30℃200rpm分別進(jìn)行主培養(yǎng);當(dāng)OD600達(dá)4
4、~6左右時(shí),3000rpm離心5min,BMMY培養(yǎng)液重懸菌體使OD600達(dá)1.5左右,與主培養(yǎng)時(shí)溫度保持一致,200rpm進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá),甲醇濃度控制在1%,連續(xù)誘導(dǎo)120小時(shí)。每12h取菌液進(jìn)行SDS-PAGE電泳,鑒定目的蛋白的表達(dá)情況。
結(jié)果:全基因人工合成方法所合成的重組人osf-1基因的堿基序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中基因序列號(hào)為NM_002825的目的基因的堿基序列完全一致;pPIC9k/hrosf-1重組質(zhì)粒構(gòu)
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