豬粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因在畢赤酵母中的表達(dá)研究.pdf

1、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)是一種具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子。GM-CSF對(duì)機(jī)體炎癥，腫瘤以及其他一些疾病都有較好的抑制或輔助治療作用，同時(shí)還具有明顯的免疫增強(qiáng)作用，具有很好的應(yīng)用前景。研究具有生物學(xué)活性的GM-CSF蛋白的體外表達(dá)具有重要意義。本研究開(kāi)展了豬GM-CSF(pGM-CSF)基因畢赤酵母體外表達(dá)研究。
　　 1、畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K-pGM的構(gòu)建研究
　　 針對(duì)含有pGM-CSF全

2、部編碼區(qū)基因的載體19T-GM設(shè)計(jì)一對(duì)引物，擴(kuò)增出pGM-CSF去信號(hào)肽的成熟編碼區(qū)基因，大小為384bp; pGM-CSF基因插入pMD19-T Simple Vector，成功構(gòu)建pMD19-T-pGM克隆質(zhì)粒；pMD19-T-pGM經(jīng)EcoR I和Ⅳot I雙酶切后，回收pGM-CSF基因，插入經(jīng)相同雙酶切處理的載體pPIC9K中，構(gòu)建畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K-pGM，對(duì)pPIC9K-pGM進(jìn)行PCR鑒定和雙酶切鑒定，結(jié)果表明

3、成功構(gòu)建pPIC9K-pGM表達(dá)載體。
　　 2、GS115/pPIC9K-pGM重組菌的篩選
　　 將pPIC9K-pGM經(jīng)Sac I線(xiàn)性化再乙醇沉淀回收，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母宿主菌GS115感受態(tài)細(xì)胞，接種于YPD平板上，在30℃培養(yǎng)3d，培養(yǎng)基長(zhǎng)出乳白色菌落，表明pPIC9K-pGM重組子轉(zhuǎn)化成功；重組子進(jìn)行G418/YPD濃度梯度篩選，結(jié)果在4mg/mL的G418/YPD培養(yǎng)基上獲得高拷貝重組子；將高拷貝重組子進(jìn)行表型

4、鑒定篩選，成功篩選到Mut+型高拷貝重組子；將Mut+型高拷貝重組子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出預(yù)期的384bp片段，表明重組子篩選正確，并將此高拷貝重組菌命名為GS115/pPIC9K-pGM。
　　 3、GS115/pPIC9K-pGM重組菌在畢赤酵母中表達(dá)
　　 將GS115/pPIC9K-pGM于BMGY培養(yǎng)基中激活培養(yǎng)至OD600達(dá)2.0～2.5時(shí)收集菌體，BMMY培養(yǎng)基調(diào)至OD600=1.0，于30℃，300r/m

5、的空氣培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)表達(dá)，同時(shí)每24h添加甲醇一次，使其終濃度為1％(v/v)。將表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行間接ELISA和SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果表明pGM-CSF獲得表達(dá)，表達(dá)蛋白的分子量約為18kD，且表達(dá)最佳時(shí)間為4d。將表達(dá)蛋白進(jìn)行western-bloting分析，結(jié)果表達(dá)蛋白能與pGM-CSF陽(yáng)性血清特異性結(jié)合，表明產(chǎn)物具有反應(yīng)原性。將表達(dá)的pGM-CSF蛋白過(guò)濾除菌后進(jìn)行TF-1細(xì)胞增殖試驗(yàn)，該蛋白具有促進(jìn)TF-1細(xì)胞增殖的能力，且