小鼠反向體細(xì)胞核移植方法的研究.pdf

1、雖然通過核移植技術(shù)，很多哺乳動(dòng)物被克隆成功，但核移植的總體效率低于5％。而且傳統(tǒng)核移植操作程序復(fù)雜，對(duì)設(shè)備和技術(shù)要求較高，阻礙了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。誘導(dǎo)去核(induced enucleation，IE)對(duì)卵母細(xì)胞損傷小，去除較少的胞質(zhì)量和蛋白、分子成分就可以達(dá)到去核目的。但是DC誘導(dǎo)去核的胞質(zhì)被預(yù)先激活，用作受體時(shí)已經(jīng)達(dá)到末期(TII phase)，然而MII去核卵母細(xì)胞被公認(rèn)為是最好的受體，而且核移植之后的延期激活對(duì)供體核的重編是非常

2、重要的，從而導(dǎo)致誘導(dǎo)去核的受體胞質(zhì)支持重構(gòu)胚發(fā)育的能力較低，限制了誘導(dǎo)去核方法在體細(xì)胞核移植技術(shù)上的應(yīng)用。本研究嘗試通過反向核移植技術(shù)(reverse-order nuclear transfer,RNT)與誘導(dǎo)去核法相結(jié)合，探索一種最優(yōu)化的誘導(dǎo)去核反向核移植操作程序(IRNT)。因此，本研究以ICR小鼠卵母細(xì)胞為材料，進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)： 1．實(shí)驗(yàn)對(duì)比了透明帶磨口刺入和透明帶直接刺入兩種去核方法、蔗糖處理、細(xì)胞松弛素B(CB)濃度

3、及去核針內(nèi)徑對(duì)小鼠卵母細(xì)胞去核效率的影響，及CB濃度對(duì)去除部分胞質(zhì)的孤雌胚早期發(fā)育的影響。結(jié)果顯示：(1)添加3％蔗糖與對(duì)照組之間的去核效率無影響(P>0.05)；(2)CB濃度為5、10和20μg/mL時(shí)，磨口法的去核成功率差異不顯著(P>0.05)，刺入法在CB濃度為5和10μg/mL時(shí)去核成功率顯著高于20μg/mL組(P<0.05)，磨口法去核成功率顯著高于刺入法(P<0.05)；(3)去除部分胞質(zhì)的孤雌胚卵裂率各實(shí)驗(yàn)組之間差異

4、不顯著(P>0.05)，20μg/mL CB處理組囊胚率顯著低于其它處理組(P<0.05)；(4)在去核針內(nèi)徑為10、15和20μm時(shí)，磨口法去核成功率差異不顯著(P>0.05)，刺入法應(yīng)用20μm去核針的去核成功率顯著低于其它組(P<0.05)。結(jié)果表明，磨口法在10μg/mL CB和15μm內(nèi)徑去核針條件下提高了去核效率(成功率為90.8％，速度為50 s/個(gè))，且不影響孤雌胚的體外發(fā)育率。 2．比較了乙醇、SrCl<,2>

5、兩種激活方法和卵齡對(duì)脫羰秋水仙堿(Demecolcine，DC)誘導(dǎo)去核率和孤雌激活第二極體排除率的影響。結(jié)果顯示，注射hCG后不同時(shí)間采集的卵母細(xì)胞，無論是乙醇還是SrCl<,2>激活處理后的IE率隨卵齡的增加先顯著升高，后又降低，注射hCG后20～21 h采集的卵母細(xì)胞IE率顯著高于其它組(p<0.01)；注射hCG后相同時(shí)間采集的卵母細(xì)胞，乙醇和SrCl<,2>激活處理后的IE率差異不顯著(p>0.05)；隨卵齡的增加卵母細(xì)胞第二

6、極體排出率有先升高后降低的趨勢，在注射hCG后20～21 h采集卵母細(xì)胞第二極體排出率達(dá)到最高，且第二極體排出率顯著高DC處理組，說明DC處理對(duì)第二極體排出有抑制作用。結(jié)果表明，SrCl<,2>在小鼠卵母細(xì)胞誘導(dǎo)去核中的作用效果與乙醇相同，注射hCG后20～21 h采集的卵母細(xì)胞的IE率較高(乙醇為62.6％； SrCl2為56.8％)。 3．本研究優(yōu)化了IRNT中DC的作用起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間，并比較了誘導(dǎo)去核反向核移植、誘導(dǎo)去

7、核正向核移植和傳統(tǒng)顯微操作核移植方法對(duì)重構(gòu)胚發(fā)育能力的影響。結(jié)果顯示，電融合后用DC處理與乙醇激活后用DC處理的反向核移植成功率差異不顯著(p>0.05)；反向核移植成功率在乙醇激活后處理60 min時(shí)顯著高于處理40min組(p<0.01)，與處理90和120 min組差異不顯著(p>0.05)，但隨處理時(shí)間延長有下降趨勢，處理90 min后，③的比例不再變化，④的比例顯著增加(p<0.01)，供體核有可能被排出胞外，導(dǎo)致反向核移植成