芹菜素通過調節(jié)transgelin蛋白抑制結直腸癌的生長及轉移.pdf

1、背景:
　　 結直腸癌(colorectalcancer，CRC)一直是很受關注的健康問題，在世界范圍內每年發(fā)病超過100萬，是引起死亡的第二大原因。結直腸癌的發(fā)病原因及機制至今尚未闡明。CRC的發(fā)生是由遺傳因素及生活方式相關因素決定的。結直腸癌早期以外科手術治療為首選。然而，診斷為CRC的病人大約40％將來會發(fā)生轉移，在此時，輔助治療和姑息治療尤為顯得重要，無論是在提高療效、延長壽命還是改善生活質量方面都發(fā)揮著重要作用。然而，

2、現(xiàn)有的化療藥品種少，有效、低毒、價廉的更少，分子靶向藥物雖為結直腸癌治療提供了新的途徑，但其應用及效果也不是很確切，且價格昂貴。隨著患者對現(xiàn)有化療藥產生耐藥后，治療效果也明顯下降，在這種種現(xiàn)實情況下，對新的低毒、高效、價廉的藥物的研究是十分必要的。
　　 黃酮類化合物廣泛存在于水果、蔬菜、茶等植物源性食物中，許多中藥發(fā)揮作用的主要成分也是黃酮。黃酮類化合物由于結構特征不同，而表現(xiàn)出不同的生物活性，包括細胞生物信號活化、抗炎癥反應

3、、抗血管生成、抗氧化、抗炎、抗腫瘤作用。已被證實具有抗多種腫瘤侵襲和/或轉移的活性，包括腦，口腔，咽，甲狀腺，乳腺，肺，肝臟，膽管，胰腺，睪丸，小腸，結腸，腎，卵巢，宮頸，前列腺，和表皮等癌癥;還包括纖維肉瘤，骨肉瘤，卡波西氏肉瘤，和黑色素瘤等。
　　 芹菜素(apigenin，API)是一種天然的黃酮類化合物，與其他的黃酮類化合物相比，其因毒性更低，療效更顯著，作為一種腫瘤化學預防用藥受到廣泛的關注。芹菜素具有多種生物學活性和

4、藥理作用，在體外以及體內眾多的哺乳動物系統(tǒng)中的芹菜素的生物效應與其抗氧化作用及其清除作用自由基有關。此外，它還具有抗突變、抗炎、抗病毒、抑制腫瘤細胞增殖、誘導凋亡、放化療增敏等作用。近年研究表明，芹菜素抗腫瘤的主要作用機制是抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞侵襲轉移及干擾腫瘤細胞的信號途徑等。芹菜素可以抑制如前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌、結腸癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，其抗腫瘤作用表現(xiàn)出多樣性。
　　 然而，芹菜素對結直

5、腸癌作用的研究較少，尤其是其抗結直腸癌轉移及機制研究缺乏。本研究通過觀察芹菜素對整體可視化裸鼠原位結直腸癌模型的作用及人結腸癌細胞SW480的生物學行為包括細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡、細胞運動及侵襲能力的影響，闡明其在結直腸癌中發(fā)揮的作用，同時通過雙向電泳技術篩選差異蛋白，飛行質譜技術鑒定差異蛋白鑒定出transgelin(TAGLN，SM22)蛋白。Transgelin是一個分子量為22kDa-25kDa的細胞骨架蛋白，研究發(fā)現(xiàn)其與

6、腫瘤的惡性轉化或癌變的進展密切聯(lián)系。另外研究發(fā)現(xiàn)transgelin是一種新型的MMP-9表達的轉錄調控因子，Transgelin通過一個氨基酸總站調寧蛋白同源結構域經由ERK激活受損的方式降低AP-1依賴的反式活化從而抑制MMP-9表達。研究推測癌癥時transgelin的表達降低可能是在這些腫瘤MMP-9表達提高明顯的部分原因。故而在以上背景下，本研究進一步探索芹菜素是否通過調節(jié)transgelin、MMP-9表達而達到抗腫瘤的目的

7、，為芹菜素抗腫瘤尋找分子機制理論依據。
　　 目的:
　　 本研究旨在研究黃酮類天然藥物芹菜素對結直腸癌的作用，并且探索芹菜素發(fā)生這些效應的分子機制，為芹菜素抗腫瘤尋找分子生物學層面理論依據。為芹菜素應用于臨床提供更可靠依據，且可能為治療結直腸癌提供新的作用靶點。
　　 方法:
　　 芹菜素作用于可視化結直腸癌裸鼠模型的研究
　　 根據文獻方法建立可視化裸鼠原位結直腸癌動物模型，芹菜素按100mg

8、/kg/d灌胃，于瘤體可于成像系統(tǒng)觀察到開始給藥，接種42天后將成像觀察到原位實體瘤12只裸鼠隨機分為兩組，每組6只，一組芹菜素干預組，一組溶劑對照組。實驗前記錄裸鼠體重及應用活體成像系統(tǒng)觀察瘤體。實驗期間動態(tài)測量裸鼠體重、動態(tài)觀察腫瘤體積改變、腫瘤轉移情況。實驗結束后裸鼠原位種植實體瘤重量測量，腫瘤轉移情況觀察。
　　 MTT法檢測對人結腸癌細胞增殖的影響
　　 常規(guī)培養(yǎng)人結腸癌細胞，處于生長對數(shù)期時進行實驗，實驗時分

9、成5組:即20，40，80，120μM芹菜素組及溶劑對照組。每個劑量組設5個復孔，加藥后分別培養(yǎng)24和48h。MTT法檢測對人結腸癌細胞增殖的影響。根據下列公式計算芹菜素對人結腸癌細胞的抑制率:抑制率=(1-實驗藥物組OD值/空白對照組OD值)×100％。
　　 劃痕損傷試驗
　　 實驗分為兩組，一組為芹菜素組(40μM)，一組為溶劑對照組，觀察干預24h及48h后SW480細胞劃痕修復能力即細胞遷移能力。
　　

10、 Transwell小室侵襲試驗
　　 實驗分為兩組，一組為芹菜素組（40μM），一組為溶劑對照組，干預24h及48h后，通過Transwell小室侵襲試驗觀察兩組細胞侵襲能力。
　　 流式細胞術分析細胞周期
　　 實驗時分成5組:即20，40，80，120μM芹菜素組及溶劑對照組，培養(yǎng)24或48h結束后PI溶液染色，調細胞數(shù)為（1-5）×105/mL，流式細胞儀檢測檢測細胞周期各時相的變化，細胞周期結果分析以M

11、odifit2.0軟件分析。
　　 Hoechst33258染色檢測細胞凋亡
　　 SW480細胞以2×105/孔的密度按以上實驗分組于6孔板中培養(yǎng)，干預48h后，Hoechst33258染色液染色檢測各組凋亡情況。
　　 AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測
　　 SW480細胞以2×105/孔的密度按以上實驗分組于6孔板中培養(yǎng)，干預48h后，AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒染色。于熒光顯

12、微鏡下雙色濾光片觀察。AnnexinV-FITC熒光信號為綠色，PI信號為呈紅色。
　　 雙向電泳技術篩選飛行質譜技術鑒定差異蛋白
　　 實驗分為芹菜素組（40μM）和溶劑對照組，干預48h后，抽提線粒體蛋白，通過雙向電泳技術篩選兩組表達差異的蛋白，飛行時間質譜技術鑒定差異蛋白。
　　 細胞免疫熒光技術驗證差異蛋白的表達
　　 實驗分為芹菜素組(40μM)和溶劑對照組，干預12h或24h，通過免疫熒光雙染

13、觀察差異蛋白在線粒體的表達及在細胞內的表達及易位情況。
　　 qPCR技術檢測芹菜素干預后差異蛋白mRNA的表達情況
　　 實驗時分成5組:即20，40，80，120μM芹菜素組及溶劑對照組，干預24h。通過qPCR技術檢測芹菜素干預后差異蛋白mRNA的表達情況。
　　 Westernblot技術檢測芹菜素干預后差異蛋白的表達情況
　　 1)實驗分為芹菜素組(40μM)和溶劑對照組，干預48h，抽提線粒體

14、蛋白、胞漿蛋白、核蛋白，觀察差異蛋白在線粒體、細胞漿及細胞核中的表達情況。
　　 2)實驗時分成5組:即20，40，80，120μM芹菜素組及溶劑對照組，干預48h。抽提總蛋白，驗證芹菜素干預對差異蛋白表達的影響。
　　 RNAi技術觀察干擾差異蛋白基因表達后SW480細胞的生長情況
　　 將差異蛋白基因siRNA通過脂質體轉染到SW480細胞，觀察瞬時轉染siRNA對SW480細胞生長的影響。
　　 組

15、織芯片免疫組化技術觀察不同組織類型差異蛋白表達情況
　　 通過免疫組化技術觀察人大腸腺癌組織(n=30)、淋巴結轉移病灶(n=25)及肝臟轉移病灶(n=5)差異蛋白的表達情況。
　　 統(tǒng)計分析
　　 所有數(shù)據采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理，實驗數(shù)據計量資料用均數(shù)±標準差（(x)±s）表示;各組間比較采用重復測量方差分析;多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，方差不齊的采用Tamhane'

16、sT2法;兩組比較根據是否服從正態(tài)分布而選擇用兩獨立樣本t檢驗或采用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗;顯著性標準為α=0.05，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 在體實驗結果
　　 在體實驗結果顯示:與模型組比較，芹菜素具有抑制結直腸癌細胞在裸鼠體內生長的作用;芹菜素處理后裸鼠瘤體相對熒光強度減弱，經兩獨立樣本t檢驗分析，統(tǒng)計量t值分別為-14.958，P值小于0.001，差異有統(tǒng)計學意義，芹菜

17、素可以抑制裸鼠腫瘤的生長。兩組大腸均可見不同程度的綠色熒光，表明兩組大腸均有不同程度的腫瘤生長，經IPP6.0軟件對各組織熒光進行半定量分析，再對熒光強度值進行獨立樣本t檢驗，統(tǒng)計量t值為-4.630，P值為0.000，兩組裸鼠大腸腫瘤生長情況差異有統(tǒng)計學意義。芹菜素組裸鼠僅1只出現(xiàn)明顯肝臟轉移病灶，腫瘤生長能力較弱，模型組6只均有不同程度的肝臟轉移病灶，腫瘤生長能力較強，通過IPP6.0軟件對各組織熒光進行半定量分析，再對熒光強度值進

18、行獨立樣本t檢驗，統(tǒng)計量t值為-4.917，P值0.000，差異有統(tǒng)計學意義，結果表明芹菜素具有降低結直腸癌細胞在裸鼠體內的肝轉移能力的作用。
　　 細胞實驗結果
　　 MTT結果顯示:不同濃度芹菜素作用于人結腸癌SW480細胞24及48h后細胞生長抑制率應用One-WayANOVA方差分析得出，不同濃度芹菜素干預24h或48h后SW480細胞生長抑制率差異有統(tǒng)計學意義，F(xiàn)值分別為318.645、156.662，P值均小

19、于0.001，從藥物從濃度因素看，應用LSD法進行多重比較顯示，40μM和80μM濃度組之間無顯著性差異，P＞0.05，余濃度組之間具有顯著性差異，P＜0.05;從藥物作用時間因素看，應用兩獨立樣本t檢驗顯示，不同作用時間兩兩比較DMSO組差異無統(tǒng)計學意義P＞0.05，其他組差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.05。芹菜素可以抑制結直腸癌SW480細胞的生長，在高于80μM的濃度后出現(xiàn)抑制作用平臺期。
　　 劃痕損傷修復實驗結果顯示:40

20、μM芹菜素作用24h及48h均能降低SW480細胞的遷移能力，與溶劑對照組的細胞遷移率相比，差異具有統(tǒng)計學意義(t值分別為6.469，12.751，P值均小于0.001)。
　　 Transwell小室基質侵襲實驗結果顯示:用40μM芹菜素處理SW480細胞24及48h后，腫瘤細胞的體外侵襲能力明顯下降。24h芹菜素組與溶劑對照組的侵襲細胞數(shù)分別為13.11±3.26和67.78±14.21，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(t=11.

21、249，P＜0.001)。48h芹菜素組與溶劑對照組的侵襲細胞數(shù)分別為91.38±12.98和228.50±78.76，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(t=-4.859，P=0.002)。
　　 33258染色顯示:不同濃度芹菜素處理SW480細胞凋亡率應用重復測量方差分析，差異無統(tǒng)計學意義(F=2.027，P=0.147)，提示芹菜素無促進SW480細胞凋亡的作用。
　　 AnnexinV-FITC染色顯示:兩組凋亡細胞所占

22、總細胞數(shù)比值相似，故芹菜素引起SW480細胞凋亡與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(t=0.044，P=0.198)。
　　 流式細胞術檢測顯示:經不同處理后流式細胞儀檢測細胞周期，應用重復測量方差分析得出，SW480細胞經不同濃度芹菜素處理不同時間后，與對照組相比，不同濃度組間48hG0/G1、S、G2/M期細胞分布有顯著性差異(F值分別為28.781,4.972，46.475，P值均小于0.05)，24hG0/G1、S、G2/M期

23、細胞分布差異均無統(tǒng)計學意義（F值分別為1.403，1.013，1.886，P值均大于0.05）。芹菜素作用48h抑制SW480細胞周期，使其停滯在G2/M期。
　　 雙向電泳篩選出12個蛋白，經飛行時間質譜鑒定出9個，我們選擇transgelin蛋白作進一步研究。
　　 免疫熒光結果顯示:transgelin蛋白在細胞漿、細胞核、線粒體均有表達，且在細胞核中的表達最高，在12h及24h均未出現(xiàn)明顯易位情況，提示芹菜素作用

24、后線粒體蛋白的增加并不是通過蛋白的易位引起。
　　 QPCR檢測結果顯示:不同濃度芹菜素處理SW480細胞24htransgelin的總mRNA的表達有差異，芹菜素上調transgelin的mRNA的表達，差異有統(tǒng)計學意義(F=498.798，P＜0.001。)
　　 Westernblot檢測結果顯示:
　　 1)transgelin蛋白的表達在細胞漿、細胞核及線粒體中均有表達，且以細胞核中表達最多，與免疫熒光

25、結果一致。
　　 2)芹菜素處理48h后上調SW480細胞transgelin蛋白的表達，與未加芹菜素處理相比，差異有統(tǒng)計學意義（F=13.312，P=0.001）。隨著芹菜素濃度的增加，transgelin蛋白上調越明顯，20μM芹菜素組與空白對照組和溶劑對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，而40、80、120μM芹菜素組與空白對照組和溶劑對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P值分別為0.042，0.007，0.000)

26、，與前述雙向電泳蛋白篩選飛行質譜鑒定結果相一致。芹菜素處理48h后SW480細胞MMP-9蛋白的表達下調，與未加芹菜素處理相比，差異有統(tǒng)計學意義（F=20.396，P＜0.001）。以80μM芹菜素組下調最明顯。
　　 RNAi結果顯示:transgelin-siRNA干擾SW480細胞48h后，SW480細胞的生長加快，與陰性對照組和LIPO對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(F=134.583，P=0.000)。siRNA433組

27、細胞的生長最快，是NC組的1.35倍。
　　 組織芯片免疫組化結果顯示:人結腸癌腺癌組織transgelin蛋白的表達比轉移病灶組織高，差異有統(tǒng)計學意義（Z=-2.075，P=0.038）。表明transgelin蛋白表達低的結腸癌細胞轉移能力強。
　　 結論:
　　 1)芹菜素具有抑制結直腸癌生長及肝轉移作用，其與芹菜素抑制SW480細胞的生長及侵襲相關，其作用機制可能與芹菜素提高transgelin的表達、降