介導破骨細胞生成的新信號轉導蛋白及骨髓瘤骨病新治療靶點的初步探索.pdf

1、目的：多發(fā)性骨髓瘤（Multiple Myeloma，MM）患者RANKL表達異常增高使RANKL/RANK信號系統(tǒng)過度激活，導致破骨細胞（Osteoclast，OC）大量生成且功能亢進在骨髓瘤骨?。∕yeloma bone disease，MBD）的發(fā)生、發(fā)展中起關鍵作用，因此抑制RANKL/RANK信號轉導途徑從而抑制OC的形成及其破骨功能是治療MBD有效方法之一。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)RANK蛋白上存在一個新基序：IVVY，介導了一條

2、OC形成所必需的新信號轉導途徑。本研究的目的就是要利用這個全新的RANK基序，尋找和鑒定出與新基序IVVY相互作用而且介導破骨細胞生成的、目前尚未知的下游信號轉導蛋白，以進一步揭示RANKL/RANK系統(tǒng)激活引起破骨細胞形成的細胞信號轉導途徑（signaling pathway）。那么，這一信號轉導途徑及其信號轉導蛋白很大可能就是 MBD等骨病的特異性治療靶點，為研究和開發(fā)治療MBD特異性靶向藥物奠定基礎。
　　方法：⑴采用Gat

3、eway技術構建適合酵母表達的小鼠巨噬細胞cDNA文庫并進行鑒定。⑵酵母雙雜交實驗掃庫以篩選與IVVY相互作用的候選下游信號蛋白。⑶與IVVY相互作用的候選蛋白在破骨細胞中表達情況驗證。用Western Blotting技術和激光共聚焦掃描顯微鏡檢測相應蛋白表達的定量、定位及其動態(tài)分析。⑷分別利用酵母雙雜交和免疫共沉淀（coimmunoprecipitation, coIP）實驗在酵母細胞和哺乳細胞293T中驗證上述篩選到的候選蛋白與誘

4、餌蛋白Bait之間的相互作用；另外，將誘餌蛋白Bait上的IVVY基序突變成IVAF以形成突變體Bait，再重復上述酵母雙雜交和coIP實驗，來證明候選蛋白是經IVVY基序與RANK相互作用。⑸利用RNAi技術抑制巨噬細胞內這一候選蛋白的表達，以及siRNA解救技術抵消這一 RNAi作用，觀察這一蛋白被抑制后及解救后的巨噬細胞形成破骨細胞的能力和水平，從而考察這一蛋白是否具有介導破骨細胞形成的功能，從功能上進一步證實這一與IVVY基序相

5、互作用的蛋白為介導破骨細胞形成的IVVY基序下游信號轉導蛋白。⑹利用coIP、ChIP、siRNA及其解救技術來鑒定 RYBP上介導破骨細胞形成的結合結構域和功能結構域，以及RYBP介導破骨細胞形成的表觀遺傳學機制。
　　結果：①文庫總滴度達到3.9×107，酶切分析24個克隆，23個（95.83％）克隆有肯定的基因插入片段，插入片段大小范圍為0.2-5.6Kb，平均為2.27 Kb，證實此BMMs cDNA表達型文庫質量高，達到

6、標準文庫的要求。②3輪酵母雙雜交試驗，篩得10個陽性克隆的質粒，經測序分析發(fā)現(xiàn)，其中有6個是相同的，其基因庫編號（GB）是BC080287，編碼Ring1和YY1結合蛋白（Ring1 and YY1-binding protein，RYBP），其出現(xiàn)的幾率最高，意味著它是可能性最大的候選蛋白。另外3個篩選到的蛋白為：編碼ATP結合盒（ATP-binding cassette）、編碼E2F轉錄因子（E2F transcription fa

7、ctor)和熱休克蛋白8(heat shock protein8)的基因。而且，回頭檢查實驗結果也發(fā)現(xiàn)，表達RYBP蛋白的陽性克隆出現(xiàn)也最快。③在M-CSF和RANKL的刺激下，在骨髓巨噬細胞（BMMs）向破骨細胞分化過程中，Western Blotting檢測細胞內RYBP的表達量變化不大，但激光共聚焦掃描發(fā)現(xiàn)RYBP出現(xiàn)一個“從細胞核移動到細胞膜再又回到細胞核”的細胞內轉移過程，提示RYBP在破骨細胞形成過程中發(fā)生著變化，很可能與破

8、骨細胞形成密切相關。④表達候選蛋白RYBP的AD-RYBP質粒與BD-Bait質粒共轉化AH109酵母進行雙雜交實驗，不僅出現(xiàn)陽性克隆再次驗證這兩種蛋白的相互作用，即使將AD-RYBP質粒較常規(guī)稀釋1000倍，仍能檢測到蛋白之間的相互作用。⑤RYBP與Bait蛋白之間有相互作用（有共沉淀），但與Bait蛋白突變體之間無相互作用（無共沉淀），說明RYBP蛋白是經過IVVY基序與Bait（或者RANK）蛋白相互作用。⑥siRNA成功地沉默小

9、鼠BMMs細胞RYBP蛋白，而沉默了RYBP蛋白的BMMs細胞形成破骨細胞的能力明顯降低，siRNA解救技術成功解救RYBP-siRNA對破骨細胞形成的抑制作用。⑦鑒定出RYBP上介導破骨細胞形成的結合結構域，其功能結構域以及RYBP介導破骨細胞形成的表觀遺傳學機制研究仍在進行當中。
　　結論：本研究在先前發(fā)現(xiàn)RANK蛋白上新基序IVVY的基礎上，通過構建巨噬細胞的酵母表達cDNA文庫，再利用酵母雙雜交、免疫沉淀、免疫熒光、RNA