表達(dá)PrP-GFP融合蛋白神經(jīng)細(xì)胞系的建立及其初步感染性試驗.pdf

1、傳染性海綿狀腦病 (TSEs) 也稱為朊毒體病，是一種致死性神經(jīng)退化性疾病，細(xì)胞的朊蛋白(PrP<'C>)轉(zhuǎn)變成朊毒體(PrP<'Sc>)是TSEs的一個基本特征。朊蛋白的結(jié)構(gòu)包括二硫鍵、天冬酰胺糖基化位點、一個信號肽序列、一個八肽重復(fù)區(qū)、一個疏水區(qū)和一個C端的糖基磷脂酰肌醇錨定位點。研究TSEs的途徑之一是利用基因缺陷型小鼠和原初細(xì)胞模型作為工具，但是隨著研究的不斷深入，研究者更加關(guān)注基因缺陷型細(xì)胞模型和轉(zhuǎn)基因型細(xì)胞模型的利用。

2、 目前對朊毒體的生物學(xué)特性以及感染傳播過程還未研究清楚，而表達(dá)PrP/GFP融合蛋白的細(xì)胞模型是進(jìn)行這一研究的重要工具。為了獲得該細(xì)胞系，本研究以Neuro-2a細(xì)胞為基礎(chǔ)，利用pcDNA3.1(-)真核表達(dá)載體，攜帶PrP/GFP融合基因，轉(zhuǎn)染至Neuro-2a細(xì)胞，經(jīng)熒光和G418抗性的雙重連續(xù)篩選，獲得了穩(wěn)定表達(dá)PrP/GFP融合蛋白的Neuro-2a細(xì)胞系。并用癢病小鼠適應(yīng)毒株RML成功感染了篩選到的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。 根

3、據(jù)己公布的小鼠PrP基因以及pEGFP載體的GFP基因序列設(shè)計引物，分別以小鼠基因組和pEGFP質(zhì)粒為模板，PCR擴增PrP1-34aa、PrP94-254aa、PrP112-254aa和GFP基因。將PCR擴增出來的基因片段分別克隆到pGEM-T載體中，獲得pGEM-T-mPrP1-34aa、pGEM-T-mPrP94-254aa、pGEM-T-mPrP112-254aa和pGEM-T-GFP重組質(zhì)粒，并進(jìn)行測序分析。分別用XbaⅠ和

4、AgeⅠ酶切pGEM-T-mPrP1-34aa、 EcoRV 和 HindⅢ酶切pGEM-T-mPrP94-254aa、pGEM-T-mPrP112-254aa、AgeⅠ和EcoRV酶切pGEM-T-GFP以及XbaⅠ和HindⅢ酶切pcDNA3.1(-)質(zhì)粒，電泳、切膠回收酶切片段。分別將酶切回收的mPrP1-34aa、GFP、mPrP94-254aa、pcDNA3.1(-)和mPrP1-34aa、GFP、mPrP112-254aa、

5、pcDNA3.1(-)這四個片段共連接，同時本實驗分別將GFP蛋白基因序列插入到PrP基因序列的PK酶推測切割位點附近的94和112位氨基酸之前，從而分別獲得融合mPrP/GFP基因的真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3.1(-)-mPG94 和 pcDNA3.1(-)-mPG112。用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Neuro-2a神經(jīng)細(xì)胞，經(jīng)G418抗性篩選、熒光顯微鏡檢測和Western-Blotting檢測后，成功

6、獲得兩株穩(wěn)定表達(dá)mPrP/GFP融合蛋白的Neuro-2a細(xì)胞株(命名為mPG94Neuro-2a和mPG112Neuro-2a)。用癢病小鼠適應(yīng)毒株RML接種構(gòu)建的細(xì)胞株，連續(xù)培養(yǎng)10天后，每隔兩代取細(xì)胞樣品進(jìn)行Western-Blotting檢測，接種后20天檢測到耐PK酶的PrP<'Sc>，而對照N2a細(xì)胞株未檢測到耐PK酶的PrP<'Sc>。這一結(jié)果證明我們構(gòu)建的細(xì)胞株的癢病感染潛伏期變短且表達(dá)的帶3F4位點的外源蛋白能轉(zhuǎn)變成P