骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療壓力性尿失禁的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：干細(xì)胞可用于治療女性壓力性尿失禁(stress urinary incontinence，SUI)，而且目前正在進(jìn)行有關(guān)的臨床試驗(yàn)。然而，干細(xì)胞治療的作用機(jī)制并未闡明。
　　目的：本研究的目的是檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow derived mesenchymal stem cell，BM-MSC）及其分泌物對(duì)模擬產(chǎn)傷動(dòng)物模型功能及結(jié)構(gòu)的恢復(fù)作用。
　　方法：1、成年雌性大鼠BM-MSC獲取及定向分化

2、能力檢測(cè)。濃縮分泌物(Concentrated conditioned media，CCM)的獲取及微陣列蛋白檢測(cè)；2、模擬產(chǎn)傷動(dòng)物模型的制備，包括陰道擴(kuò)張(Vaginal distention，VD)和雙側(cè)陰部神經(jīng)擠壓(Pudendal nerve crush，PNC)；3、大鼠試驗(yàn)包含兩個(gè)部分，第一部分含有三個(gè)組，分別是假損傷+生理鹽水尾靜脈注射（n=15），雙重?fù)p傷+生理鹽水尾靜脈注射(n=13)，和雙重?fù)p傷+BM-MSC尾靜脈注

3、射(n=16)。第二部分含有三個(gè)組,分別是假損傷+濃縮普通培養(yǎng)基(concentrated control media，CM)腹腔注射（n=18），雙重?fù)p傷+CM腹腔注射(n=19)，和雙重?fù)p傷+CCM腹腔注射(n=17)。手術(shù)三周后進(jìn)行功能學(xué)及組織學(xué)檢測(cè)，功能學(xué)檢測(cè)包括漏尿點(diǎn)壓力(Leak point pressure，LPP)，尿道外括約肌(External urethral sphincter，EUS)肌電圖(Electromyo

4、graphy，EMG)，和陰部神經(jīng)感覺(jué)支神經(jīng)電位(Pudendal nerve sensory branch potential，PNSBP)檢測(cè)。組織學(xué)檢測(cè)包括彈性纖維蛋白染色，神經(jīng)肌肉接頭(neuromuscular junction，NMJ)和陰部神經(jīng)免疫熒光染色。
　　結(jié)果：1、從成年雌鼠股骨中獲取的骨髓在低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，到第三代(Passage3，P3)時(shí)利用流式細(xì)胞儀分選細(xì)胞間黏附分子-1(Intracelluar

5、adhesion molecule，ICAM-1)陽(yáng)性的MSC，然后使用綠色熒光蛋白(Green fluroscence protein，GFP)慢病毒載體感染MSC。體外培養(yǎng)的MSC用光鏡觀察主要呈梭形和多角形，連續(xù)傳代P8和P16后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)志檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CD29，CD90，CD54和CD45等干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)均呈陽(yáng)性，P16細(xì)胞進(jìn)行脂肪形成和成骨形成定向分化檢測(cè)，脂肪形成培養(yǎng)到20-35天后用茜素紅S染色觀察分化程度，

6、成骨形成20-35天后用油紅O和蘇木紫染色觀察分化程度。P16骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在無(wú)血清DMEM普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，使用低氧、5％CO2、37℃培養(yǎng)箱。將獲得的上清液提取出來(lái)，置于離心過(guò)濾器中并在離心機(jī)中4000rpm離心75分鐘獲得濃縮50倍的終產(chǎn)物，然后用0.22um過(guò)濾器過(guò)濾獲取的CCM并儲(chǔ)存在1.5ml離心管中。CM使用無(wú)血清DMEM離心濃縮獲得，方法類似。CCM在注射前進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和誘導(dǎo)分化試驗(yàn)，結(jié)果顯示CCM中沒(méi)有細(xì)胞存在

7、并且使用CCM培養(yǎng)的MSC生長(zhǎng)速度要顯著高于對(duì)照組。使用RayBio?大鼠蛋白抗體陣列檢測(cè)CCM中的蛋白組成發(fā)現(xiàn)了63種不同表達(dá)強(qiáng)度的細(xì)胞因子和趨化因子。
　　2、VD+PNC雙重?fù)p傷延遲了陰部神經(jīng)和尿道的功能恢復(fù)，其中LPP，EUS EMG結(jié)果顯示到第三周時(shí)雙重?fù)p傷組顯著低于對(duì)照組，而VD和PNC單獨(dú)損傷組與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異，陰部神經(jīng)橫斷(Pudendal nerve transection，PNT)組在損傷第六周時(shí)LPP

8、和EUS EMG仍顯著低于對(duì)照組?；谝陨辖Y(jié)果我們使用VD+PND雙重?fù)p傷模型作為本實(shí)驗(yàn)研究模型。
　　3、雙重?fù)p傷+生理鹽水或CM注射組在第三周時(shí)LPP顯著低于對(duì)照組，說(shuō)明尿道功能損傷和抗漏尿壓力降低。而接受MSC或CCM注射的雙重?fù)p傷大鼠三周后的LPP與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，說(shuō)明MSC和CCM均能促進(jìn)尿道功能恢復(fù)。EUS EMG振幅增加值（峰值-基礎(chǔ)值）在雙重?fù)p傷接受生理鹽水或MSC注射治療后均顯著低于對(duì)照組，EUS EMG振

9、頻和振幅增加值在其他各組中相比均無(wú)明顯差別，說(shuō)明MSC和CCM并未促進(jìn)EUS EMG的恢復(fù)。PNSBP振頻和振幅增加值（峰值-基礎(chǔ)值）在雙重?fù)p傷+生理鹽水或CM注射組均顯著低于對(duì)照組，而MSC或CCM注射組與對(duì)照組相比并無(wú)明顯差別，說(shuō)明MSC和CCM均能促進(jìn)模擬產(chǎn)傷后的神經(jīng)功能恢復(fù)。組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，雙重?fù)p傷三周后尿道外括約肌橫紋減少并且有肌肉萎縮現(xiàn)象。彈性纖維在對(duì)照組中表現(xiàn)為連續(xù)的長(zhǎng)纖維，主要出現(xiàn)在尿道外括約肌外層，與括約

10、肌平行。雙重?fù)p傷三周后這些平行于括約肌的外層長(zhǎng)纖維破壞并糾纏在一起，而括約肌內(nèi)側(cè)的彈性纖維增加并與括約肌垂直。而MSC或CCM注射組在括約肌內(nèi)側(cè)觀察到更多的新生彈性纖維，說(shuō)明MSC和CCM均能誘導(dǎo)彈性纖維的合成。尿道NMJ免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)對(duì)照組中陰部神經(jīng)軸突呈長(zhǎng)直狀，所支配的運(yùn)動(dòng)終板呈單個(gè)聚集狀，且支配較好。雙重?fù)p傷三周后，接受生理鹽水或CM注射組的陰部神經(jīng)軸突較細(xì)，所支配的運(yùn)動(dòng)終板無(wú)序且呈擴(kuò)散狀，神經(jīng)支配較差。而雙重?fù)p傷三周后，接受M

11、SC或CCM注射組的陰部神經(jīng)出現(xiàn)多個(gè)側(cè)支，運(yùn)動(dòng)終板的無(wú)序和擴(kuò)散程度較輕，說(shuō)明MSC和CCM提高了神經(jīng)肌肉接頭的恢復(fù)。陰部神經(jīng)免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組中神經(jīng)纖維呈緊湊環(huán)狀，排列整齊。雙重?fù)p傷三周后，接受生理鹽水或CM注射組的神經(jīng)纖維密度降低且形狀不規(guī)則。而雙重?fù)p傷三周后接受MSC或CCM注射組可同時(shí)發(fā)現(xiàn)正常和非正常的神經(jīng)纖維，且其密度要高于前者，說(shuō)明促進(jìn)了神經(jīng)的恢復(fù)再生。GFP免疫熒光染色并未在尿道和陰道組織中發(fā)現(xiàn)GFP標(biāo)記的MSC。

12、r>　　結(jié)論：1、從雌性大鼠骨髓中獲取的間充質(zhì)干細(xì)胞可在體外成功培養(yǎng)。GFP慢病毒載體成功感染MSC，這為后續(xù)的MSC體內(nèi)定位研究提供了條件。利用高速離心可獲得濃縮的MSC分泌物，蛋白質(zhì)陣列分析發(fā)現(xiàn)了多種細(xì)胞因子和蛋白質(zhì)，這為闡明干細(xì)胞治療SUI提供了新的思路。2、雙重?fù)p傷延遲了組織和功能的恢復(fù)，該模型可用于慢性SUI的研究。3、MSC和CCM均能促進(jìn)尿道功能和神經(jīng)的恢復(fù)，其作用主要通過(guò)纖維蛋白增加和神經(jīng)肌肉功能恢復(fù)。該研究證明無(wú)需細(xì)胞