脂肪間充質干細胞治療壓力性尿失禁的實驗研究.pdf

1、目的：本研究在體外通過改良兩步酶消化法結合差速貼壁技術分離ADSCs并標記，體外定向誘導ADSCs分化為成肌細胞。將ADSC移植至SUI大鼠的近端尿道，檢測了ADSCs移植后體內形態(tài)和分布以及尿動力學變化，及尿道及其周圍組織形態(tài)學改變，觀察間充質干細胞移植治療壓力性尿失禁大鼠是否有效可行，為壓力性尿失禁的組織工程學治療奠定基礎。
　　 方法：⑴采用改良兩步酶消化法結合差速貼壁技術分離ADSCs，對連續(xù)傳代細胞進行計數并描繪生長曲

2、線；收集P3細胞，進行細胞表面抗原流式細胞術鑒定及成脂、成骨定向分化功能鑒定；⑵以攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的慢病毒載體系統(tǒng)作為基因轉導的媒介對ADSCs進行轉染。⑶選用第2代ADSCs，經5—氮雜胞苷體外定向向成肌細胞誘導分化。在倒置顯微鏡、透射電鏡下及激光共聚焦顯微成像下觀察細胞形態(tài)學和超微結構。采用免疫細胞化學對誘導前后細胞進行Desmin檢測，采用RT-PCR和Western Blot方法對誘導后細胞sarcomeric、Des

3、min基因mRNA和蛋白表達的檢測。⑷以雙側陰部神經離斷的方法，制備大鼠SUI動物模型。模擬人體尿動力學檢查的方法，測定實驗動物的最大膀胱容量(MBV)、腹壓漏尿點壓(ALPP)、最大尿道閉合壓(MUCP)、能性尿道長度(FUL)各項指標，證實SUI動物模型制作成功。并通過HE染色、Masson特殊染色、Mallory特殊染色、電鏡超微結構對大鼠尿道橫紋肌性括約肌的顯微解剖進行研究。⑸將建模成功的33只大鼠分成ADSCs移植治療組和培養(yǎng)

4、基注射對照組，以5×106個細胞/只的細胞數移植注射到大鼠尿道中下段3、9、12點。移植2周后進行尿動力學檢測，評價動物尿動力學變化情況。通過HE染色、Masson染色、Mal1ory染色及對尿道評價細胞移植后尿道周圍組織病理變化。同時對橫紋肌性括約肌的超微結構的形態(tài)學變化觀察及采用肌肉分割法評估干細胞治療后控尿系統(tǒng)的修復。激光共聚焦掃描顯微鏡觀察移植細胞存活情況，以及采用二次諧波(SHG)成像技術探測尿道周圍SHG峰值信號，定量評價膠

5、原蛋白含量的變化。
　　 結果：①體外培養(yǎng)的ADSCs主要呈梭形和多角形，細胞表達CD44、CD90，不表達CD34、CD45、CD106；細胞成脂、成骨定向分化誘導后油紅-O染色、茜素紅染色陽性。倒置相差熒光顯微鏡下，GFP轉染大鼠ADSCs發(fā)出綠色熒光，熒光強度隨MOI值的增加而增強，但以MOI為8的病毒感染大鼠ADSCs熒光強度最強，傳至P3時GFP陽性細胞達82％-86％。②ADSCs經5-Aza等誘導分化后其形態(tài)發(fā)生改

6、變，細胞大小不一致；在透射電鏡、激光共聚焦顯微成像系統(tǒng)下觀察到，逐漸山長梭形變?yōu)槎嘟切渭靶切危毎砻嬗性S多微絨毛；細胞器豐富，胞質內可見豐富的線粒體、粗面內質網，胞漿內可見肌絲樣結構。誘導后細胞表達結蛋白Desmin。RT-PCR、Western Blot結果證實，誘導細胞結蛋白Desmin基因的表達明顯高于對照組(P＜0.05)。⑨雌性SD大鼠的尿道為一長約2.0 cm的管狀結構。其組織結構由外向內依次為環(huán)形橫紋肌層、環(huán)形平滑肌層、

7、縱行平滑肌層、致密結締組織層和上皮層。雙側陰部神經離斷的方法能成功制造大鼠SUI模型。尿動力學檢測結果：模型建立后大鼠膀胱最大容量增加(0.89±0.04)ml(P＜0.01)，腹壓漏尿點壓下降(15.46±5.49)cmH2O(P＜0.01)，最大尿道閉合壓和功能性尿道長度亦下降(7.97±3.25)cmH2O、(0.69±0.32)cm(P＜0.01)。建模后尿道及其周圍組織形態(tài)學觀察：括約肌排列松散，部分肌肉有斷裂現象，肌層變??；

8、結締組織所占比重增加，膠原纖維稀疏，排列紊亂。④尿動力學檢測ADSCs移植后尿控功能變化，ADSCs治療后大鼠膀胱最大容量下降(0.78±0.35)ml，腹壓漏尿點壓增加(15.06±4.36)cmH2O，最大尿道閉合壓和功能性尿道長度亦增加(9.69±2.57)cmH2O、(0.69±0.32)cm，與對照組比較各指標均有顯著性意義(P＜0.01)。ADSCs移植治療后可以使注射局部尿道肌層得到明顯的加強和增厚，括約肌形態(tài)及功能得到明

9、顯的改善，周圍結締組織緊密，支撐作用得到加強。橫紋肌肌肉分割分析顯示干細胞治療4周橫紋肌肌肉面積及其長短軸比值均得到明顯增加。移植治療后尿道周圍的膠原蛋白含量明顯高于對照組(P＜0.01)。
　　 結論：⑴通過消化分離，percoll密度梯度離心和preplate差速貼壁技術，可以獲得純度較高的SD大鼠ADSCs。本實驗使用攜帶GFP基因重組的慢病毒成功高效地轉染了ADSCs，該方法為長期觀測ADSCs的體內狀況創(chuàng)造了條件。⑵本

10、研究提示：在特定誘導條件下ADSCs能被定向誘導分化為成肌細胞；并為SUI的干細胞移植治療提供了新的思路。⑶本部分研究通過雙側陰部神經離斷的方法，成功建立了SUI的動物模型，為后續(xù)實驗奠定了基礎。尿道橫紋括約肌呈封閉環(huán)形分布于雌性大鼠尿道的中外段，提示此處為控尿機制的主要部位。⑷ADSCs移植至壓力性尿失禁模型大鼠后能存活、分化而整合至宿主尿道括約肌，改善壓力性尿失禁大鼠的尿控功能，并且主要可能通過在體內定向分化為肌細胞，增強尿道括約肌