心鈉素在原代培養(yǎng)大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)元細胞中的表達.pdf

1、目的：觀察心鈉素（atrial natriuretic peptide，ANP）在原代培養(yǎng)大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)元細胞（spiral ganglion neurons，SGN）中是否表達，并探討其意義。
　　方法：1.對3～5日的新生SD大鼠耳蝸SGN進行原代培養(yǎng)以及純化，倒置顯微鏡下進行細胞形態(tài)學觀察；應用免疫細胞化學方法（免疫酶標以及免疫熒光法）檢測原代培養(yǎng)SGN中神經(jīng)元特異性核蛋白（neuron-specific nuclear

2、protein，NeuN）表達情況，進行培養(yǎng)細胞的神經(jīng)源性鑒定。
　　2.應用免疫細胞化學方法檢測原代培養(yǎng)的SGN中ANP的表達情況，運用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應（reverse-transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）方法檢測原代培養(yǎng)的SGN中是否存在編碼ANP的mRNA。
　　結(jié)果：1.SGN的原代培養(yǎng)：細胞貼壁并生長24h后，多數(shù)SGN呈雙極神經(jīng)元特征形態(tài)，胞體兩極伸

3、出突起，可達胞體的2～5倍，并附著在成纖維細胞形成的單層細胞層表面生長；有的呈三極神經(jīng)元形態(tài)，神經(jīng)突向三個方向伸展。48～72h后，可見細胞突起交織成網(wǎng)狀的細胞群，個別細胞突起可達胞體的7～8倍。還可見扁平多角形大胞體的成纖維細胞，以及長梭形雙極的雪旺細胞（schwann cells）等非神經(jīng)細胞。
　　2.SGN的免疫細胞化學：可見NeuN在SGN胞體和突起中具有陽性表達，而扁平多角形的成纖維細胞與長梭狀雪旺細胞NeuN染色陰性

4、；SGN的胞質(zhì)中含有大量棕黃色ANP免疫反應陽性物質(zhì)，為分散或成團的顆粒。免疫熒光染色顯示原代培養(yǎng)SGN中NeuN、ANP、Hoechst熒光信號的共表達：紅色熒光顯示NeuN在橢圓形胞體和神經(jīng)突起著色；綠色熒光顯示ANP主要在細胞胞體和突起中著色，在近胞核周圍的胞質(zhì)中分布尤為密集；藍色熒光為Hoechst襯染胞核。
　　3.ANP-mRNA在原代培養(yǎng)SGN細胞中的表達：培養(yǎng)5日SGN提取的RNA用RT-PCR方法擴增出編碼ANP