中藥小復方“松友飲”通過下調分化抑制因子1(ID1)抑制肝癌“干性”提高肝癌對化療敏感性研究.pdf

1、研究背景：
　　肝細胞性肝癌（以下簡稱肝癌）在全球的發(fā)病率仍呈上升趨勢，發(fā)病率已居于惡性腫瘤發(fā)病率的第5位，死亡率居第三位。手術切除、局部消融對于早期肝癌可獲得50-60％的5年生存率。然而，由于肝癌病人或因合并嚴重的肝硬化，或診斷時已經存在肝內的轉移，無法接受手術切除及局部消融等根治性治療方法。因此超過70％的肝癌需要接受非根治性的治療方法，如肝動脈栓塞化療、索拉非尼治療或系統(tǒng)性化療。然而，無論是局部的肝動脈栓塞化療，或者系統(tǒng)性

2、的化療，治療肝癌的主要困難是有效率低，即便是治療有效的患者，多數(shù)仍因肝癌的進展或者轉移而導致治療的失敗。而治療失敗的主要原因是當前治療方案雖然可造成肝癌組織細胞的壞死，但難以完全殺滅肝癌干細胞。而且已有的研究，包括我們課題組的前期研究確已證明，化療可引起殘余肝癌細胞生物學特性的惡化，包括上皮細胞間質化改變的發(fā)生。因此，進一步研究當前治療存在的問題，以及通過適當?shù)母深A提高現(xiàn)有的治療方法的效果，無疑對提高肝癌患者治療效果，改善肝癌患者的預后

3、有重要的意義。
　　方法：選用人肝癌細胞株MHCC97H（高轉移潛能）和Hep3B（低轉移潛能），梯度濃度奧沙利鉑序貫培養(yǎng)細胞株，使肝癌細胞株獲得耐受奧沙利鉑的特性并可穩(wěn)定生長，獲取細胞株并命名為MHCC97H-OXA和Hep3B-OXA，檢測該細胞“干性”(stemness)相關特征及標志物變化。對奧沙利鉑耐藥的細胞株及母代細胞株經裸鼠肝癌原位成瘤，尾靜脈注射奧沙利鉑，比較觀察腫瘤大小、裸鼠體重及肺轉移情況。為了研究化療處理后對

4、肝癌成瘤能力的影響，先裸鼠肝癌皮下成瘤經過化療后的肝癌組織裸鼠再經肝臟原位接種，比較化療后腫瘤大小、肺轉移、耐藥性的改變等“松友飲”過濾除菌，調整濃度至2mg/ml培養(yǎng)肝癌細胞株MHCC97H和Hep3B，4周后獲取穩(wěn)定培養(yǎng)的細胞株并命名為MHCC97H-SYY和Hep3B-SYY，檢測細胞“干性“相關特征及EMT、CSC指標變化?！八捎扬嫛甭?lián)合奧沙利鉑治療裸鼠原位肝癌，觀察腫瘤大小、肺轉移;全基因組芯片篩選奧沙利鉑治療組和對照組肝癌皮

5、下瘤差異基因，免疫組化和westernblot進行驗證，同時在松友飲治療后的組織和細胞株中進行驗證，構建慢病毒干擾/過表達目基因的穩(wěn)定細胞株，進行功能驗證。
　　結果：奧沙利鉑處理后的肝癌細胞株表現(xiàn)為凋亡數(shù)增加、增值速度降低、侵襲能力增強、克隆形成能力增強、CSC比例增加且呈EMT改變;裸鼠原位成瘤，尾靜脈注射奧沙利鉑5周后裸鼠體重下降(P=0.0296)，肺轉移結節(jié)數(shù)增加(P=0.0124)。經奧沙利鉑治療后的肝癌組織再接種原位

6、，同樣發(fā)現(xiàn)成瘤能力增強(P=0.046)，肺轉移增加(P=0.0013)，耐藥性增加和肝內播散增加;“松友飲”培養(yǎng)的肝癌細胞株其中CSC比例下降，呈MET改變，對奧沙利鉑敏感性增加，克隆形成能力降低。裸鼠原位成瘤后“松友飲”聯(lián)合奧沙利鉑治療組較單用奧沙利鉑組瘤體明顯縮小(P=0.0069)，肺轉移結節(jié)數(shù)也明顯減少(P=0.014);全基因組芯片及免疫組化提示奧沙利鉑處理過后的肝癌皮下瘤組織中ID1明顯增加，而“松友飲”處理過的肝癌組織及

7、細胞株則表達明顯降低，進一步構建ID過表達和干擾的細胞穩(wěn)定株，發(fā)現(xiàn)ID1慢病毒干擾穩(wěn)定株PLVT750侵襲能力減弱(P=0.0116)，對奧沙利鉑敏感性增加(P=0.0023)，成瘤能力也明顯降低，而ID1過表達細胞株PSB796侵襲能力增加(P=0.0012)，對奧沙利鉑敏感性減弱(P=0.0121)，成瘤能力明顯增強。
　　結論：
　　1.奧沙利鉑治療后的肝癌“干性”增強。
　　2.“松友飲”能夠降低肝癌的“干性”

8、，同樣也可降低奧沙利鉑化療后肝癌增強的“干性”。
　　3.下調分化抑制因子(ID1)是“松友飲”降低肝癌“干性”的關鍵作用機制之一。
　　應用價值
　　1.明確了化療后殘余肝癌細胞和組織干細胞比例增加、“干性”增強，有助于指導臨床對靶向肝癌干細胞藥物的探索，從而達到降低肝癌化療后的轉移復發(fā)。
　　2.中藥小復方“松友飲”能夠減少化療后殘余肝癌細胞和組織的干細胞比例，降低其“干性”，彌補當前療法無法除根（干細胞）的

9、缺陷，為傳統(tǒng)中藥治療肝癌提供理論依據(jù)。
　　3.中藥小復方“松友飲”聯(lián)合化療藥奧沙利鉑可作為臨床輔助治療肝癌的一種方式。
　　創(chuàng)新點：
　　1.首次用肝癌干細胞的理論解釋了傳統(tǒng)中藥小復方“松友飲”的作用機理，為中藥臨床應用提供了理論依據(jù)。
　　2.首次報道中藥小復方“松友飲”可減少肝癌組織細胞中干細胞的比例、降低其“干性”，增加奧沙利鉑治療肝癌的敏感性。
　　3.首次報道了中藥復方“松友飲”可通過下調分化抑