CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型逆轉(zhuǎn)恢復(fù)的分子機(jī)制及TRAIL的調(diào)控作用研究.pdf

1、肝纖維化是肝臟對慢性損傷的一種修復(fù)反應(yīng),是持續(xù)性肝損傷的共有病理改變,肝細(xì)胞發(fā)生持續(xù)、反復(fù)的壞死或炎癥刺激,大量纖維增生同時(shí)伴有纖維降解的相對或絕對不足,ECM在肝內(nèi)大量沉積并最終演變?yōu)楦斡不酥粮喂δ芩ソ?。近來研究認(rèn)為,肝纖維化屬可逆性病變,去除損傷因素或者應(yīng)用抗纖維化藥物,隨著恢復(fù)時(shí)間延長,肝纖維化是可以部分或者完全的逆轉(zhuǎn)恢復(fù),表現(xiàn)為沉積的膠原降解,肝臟結(jié)構(gòu)和肝臟功能的恢復(fù)。在肝纖維化逆轉(zhuǎn)這一過程中起關(guān)鍵作用的是肝星狀細(xì)胞(hepa

2、tic stellate cell,HSC)的凋亡,因此,誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡成為促進(jìn)肝纖維化恢復(fù)的重要途徑之一。研究顯示在肝纖維化形成及恢復(fù)階段,枯否細(xì)胞(Kupffer,KC)發(fā)揮了雙刃劍的作用。在肝纖維化進(jìn)展期可促進(jìn)HSC的激活,促進(jìn)肝纖維化的形成;在肝纖維化恢復(fù)期,KC及活化的HSC可通過表達(dá)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)及其他凋亡刺激因子從而促進(jìn)HSC的凋亡,促進(jìn)ECM的降解,從而抑制肝纖維化的形成。
　　然而

3、,各種細(xì)胞因子以及細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路的作用機(jī)制目前尚不清楚。為了進(jìn)一步揭示肝纖維化恢復(fù)過程中TRAIL和MAPK信號通路的作用。本研究擬選用CCl4誘導(dǎo)大鼠建立肝纖維化自發(fā)逆轉(zhuǎn)恢復(fù)模型,研究肝纖維化逆轉(zhuǎn)與TRAIL及MAPK信號通路的關(guān)系,探討參與這一過程可能的HSC內(nèi)信號傳導(dǎo)通路以及TRAIL對該通路的影響。研究內(nèi)容包括以下三個(gè)部分:
　　1.制備肝纖維化及逆轉(zhuǎn)期的動物模型
　　CCl4皮下注射為建立肝纖維化經(jīng)典方法,停止注

4、射后可自發(fā)逆轉(zhuǎn)。本實(shí)驗(yàn)中反映肝損傷和肝纖維化指標(biāo)ALT、AST、Hyp、LN、P NPⅢ,在 CCl4皮下注射12周后顯著增加,于自發(fā)恢復(fù)2,4,6,8周末逐漸降低,同時(shí),病理組織學(xué)Masson膠原染色亦顯示去除造模因素后,大鼠肝臟病理表現(xiàn)與肝纖維化分期逐漸改善,表明大鼠肝纖維化及其逆轉(zhuǎn)恢復(fù)期動物模型建立成功。
　　2.在整體動物模型上研究TRAIL和MAPK信號通路蛋白在逆轉(zhuǎn)恢復(fù)期的動態(tài)表達(dá)變化以及與肝纖維化逆轉(zhuǎn)期Hyp的相關(guān)性

5、
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,p-ERK1/2在模型組表達(dá)最低,與正常組相比差異顯著(**p<0.01),恢復(fù)4周表達(dá)最高,與模型組相比差異顯著(＃＃p<0.01),以后逐漸降至正常。p-JNK1/2在模型組表達(dá)最低(**p<0.01),恢復(fù)期增高(＃p<0.05)。p-P38在模型組表達(dá)最高(**p<0.01),恢復(fù)期逐漸降低(＃p<0.05)。TRAIL在模型組表達(dá)最低(**p<0.01),恢復(fù)2周表達(dá)最高(＃＃p<0.01),恢復(fù)4周

6、、6周、6周表達(dá)逐漸降低(＃＃p<0.01)。相關(guān)性研究顯示,TRAIL與Hyp呈負(fù)相關(guān)且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=-0.34,p=0.019);p-ERK/ERK與Hyp呈負(fù)相關(guān)且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=-0.46,p=0.003);p-JNK/JNK與Hyp呈負(fù)相關(guān)且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=-0.53,p=0.0004);p-P38/P38與Hyp呈正相關(guān)且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.81,p=0.0001)。
　　3.體外實(shí)驗(yàn)研究TR

7、AIL對經(jīng)原代灌流分離肝纖維化逆轉(zhuǎn)恢復(fù)期大鼠HSC增殖的調(diào)控
　　本實(shí)驗(yàn)采用Western blot檢測不同分組的HSC中MAPK信號通路蛋白表達(dá)和流式細(xì)胞儀法檢測不同實(shí)驗(yàn)組HSC的凋亡情況及細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn),(1)原代分離恢復(fù)四周HSC經(jīng)TRAIL(400μg/L),PD98059(30μM)預(yù)處理24h后;結(jié)果顯示與模型組相比TRAIL(400μg/L)預(yù)處理組可顯著降低恢復(fù)期HSC中p-ERK1/2表達(dá),提示在肝纖維化恢復(fù)期TR

8、AIL通過降低HSC中p-ERK1/2表達(dá),抑制HSC的增殖,促進(jìn)恢復(fù)期HSC凋亡。原代分離恢復(fù)四周HSC經(jīng)TRAIL(400μg/L), SP600125(100ng/ml)預(yù)處理24h后;結(jié)果顯示與模型組相比TRAIL(400μg/L)預(yù)處理組可顯著降低恢復(fù)期HSC中p-JNK1/2表達(dá),提示在肝纖維化恢復(fù)期TRAIL通過降低HSC中p-JNK1/2表達(dá),抑制HSC的增殖,促進(jìn)恢復(fù)期HSC凋亡。原代分離恢復(fù)四周HSC經(jīng)TRAIL(4

9、00μg/L),SB203580(50μM)預(yù)處理24h后;結(jié)果顯示與模型組相比TRAIL(400μg/L)預(yù)處理組可顯著降低恢復(fù)期HSC中p-P38表達(dá),提示在肝纖維化恢復(fù)期TRAIL通過降低HSC中p-P38表達(dá),抑制HSC的增殖,促進(jìn)恢復(fù)期HSC凋亡。(2)AV/PI雙染結(jié)果顯示,與正常組相比,逆轉(zhuǎn)期 HSC存在自發(fā)凋亡,為10.1％左右,TRAIL(100,200,400μg/L)預(yù)處理組可明顯促進(jìn)HSC的凋亡(P<0.05),

10、凋亡百分比分別為19.7%、25.1%和33.1%。提示在肝纖維化恢復(fù)期TRAIL可促進(jìn)HSC的凋亡。(3)PI單染細(xì)胞周期結(jié)果顯示,TRAIL(100,200,400μg/L)預(yù)處理組細(xì)胞24h后,與恢復(fù)期HSC相比,TRAIL各濃度預(yù)處理組,G0/G1其細(xì)胞比例明顯增加(P<0.01),S期細(xì)胞比例明顯減少(P<0.01),細(xì)胞阻滯于G1/S期。
　　綜上,本實(shí)驗(yàn)證明了在大鼠肝纖維化逆轉(zhuǎn)期MAPK信號通路與TRAIL的蛋白表達(dá)