變形鏈球菌表面蛋白PAcP與霍亂毒素B亞單位嵌合蛋白轉(zhuǎn)基因番茄可食防齲疫苗的動物實驗研究.pdf

1、齲病是一種細菌感染性疾病，變形鏈球菌是齲病的主要致病菌。免疫防齲是控制齲病的有效手段之一。近年來，利用轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)生產(chǎn)可食疫苗的研究日益發(fā)展。轉(zhuǎn)基因植物疫苗能夠通過直接口服的給藥方式誘導(dǎo)動物和人體的粘膜和系統(tǒng)免疫應(yīng)答，具有簡單、安全、穩(wěn)定、有效、經(jīng)濟等明顯優(yōu)勢，日益顯示出其廣闊的應(yīng)用前景和潛在的經(jīng)濟效益。 目的：在獲得含編碼變形鏈球菌表面蛋白PAcP和霍亂毒素B亞單位融合基因的轉(zhuǎn)基因番茄原代種子的基礎(chǔ)上，應(yīng)用分子生物學(xué)的技術(shù)檢

2、測外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達，測定目的蛋白的含量，通過免疫嚙齒類動物檢測其免疫原性，探索研制安全、經(jīng)濟的可食用防齲疫苗的可能性。 方法：本研究包括兩部分： 第一部分：提取轉(zhuǎn)基因番茄總DNA，PCR篩選含編碼變形鏈球菌表面蛋白PAcP與霍亂毒素B亞單位融合基因的轉(zhuǎn)基因番茄植株；提取番茄果實總蛋白，用BCA試劑盒測定番茄果實總蛋白含量；通過Western blot檢測外源蛋白的表達情況，并用ELISA法對外源目的蛋白含量進

3、行測定。 第二部分：轉(zhuǎn)基因番茄可食防齲疫苗免疫嚙齒類動物的研究，1、BABL／c小鼠：①分組：BABL/c小鼠18只，雌雄各半，隨機分成3組，分別為實驗組：即轉(zhuǎn)基因番茄果汁免疫組；陽性對照組：即變形鏈球菌滅活全菌免疫組；陰性對照組：即非轉(zhuǎn)基因番茄果汁免疫組。②免疫途徑：灌胃。③免疫時間：免疫4次，每次間隔一周。④樣品采集時間：分別于首次免疫前一天和每次免疫后一周采集血液、唾液樣品。⑤特異性抗體的檢測：血清中IgG和唾液中SIgA

4、采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(間接ELISA法)檢測。⑥最后一次免疫后一周處死動物，取心、肝、脾、肺、腎進行組織病理學(xué)檢查。2、SD大鼠：出生18天的SD大鼠18只，雌性，建立齲齒模型，隨機分成3組，分組情況、免疫途徑、免疫時間、樣品采集時間及特異性抗體的檢測的方法同小鼠，鼠齡70天時處死動物，并取上下頜骨，進行齲齒計分。 結(jié)果： 1.提取18株番茄總DNA，進行PCR擴增分析，其中10個樣本見1.6kb擴增條帶，出現(xiàn)特異性條帶

5、的植株占總檢測植株的55.6％；轉(zhuǎn)基因番茄總蛋白含量為3.93mg/ml，Western Blot顯示，轉(zhuǎn)基因番茄蛋白提取樣本在PVDF膜上約60KD處出現(xiàn)了一條明顯條帶，提示此帶是特異性條帶。對照番茄蛋白樣本則未見特異性條帶。測得表達的目的蛋白占番茄可溶性總蛋白的0.18％； 2.免疫后，實驗組和陽性對照組小鼠和大鼠血清特異性IgG水平和唾液特異SIgA水平與陰性對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；小鼠的SIgA較IgG先

6、升高且升高明顯。陽性對照組和陰性對照組在齲損各級中均有明顯差異(P<0.01)，實驗組和陽性對照組無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，實驗組和陰性對照組只在Dx級無統(tǒng)計學(xué)差異。 結(jié)論： 1.篩選獲得了含編碼變形鏈球菌表面蛋白PAcP和霍亂毒素B亞單位融合基因的轉(zhuǎn)基因番茄子代植株，轉(zhuǎn)基因番茄子代植株能有效表達外源蛋白，蛋白含量占番茄果實可溶性總蛋白的0.18％； 2.轉(zhuǎn)基因番茄所表達的目的蛋白具有免疫原性，能夠誘導(dǎo)嚙齒類