靶向干擾CGI-100基因?qū)Π籽562細(xì)胞增殖與分化的影響研究.pdf

1、目的：本課題通過靶向干擾CGI-100基因表達(dá)后，觀察人白血病K562細(xì)胞增殖、分化的改變，以及對(duì)苦參堿和氯化高鐵血紅素作用的反應(yīng)性的改變，研究CGI-100基因在K562細(xì)胞中的功能和作用，以及K562細(xì)胞誘導(dǎo)分化的分子機(jī)制，闡明CGI-100基因的功能，探索腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)分化的機(jī)制，為尋找腫瘤治療新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：設(shè)計(jì)及化學(xué)合成3對(duì)靶向CGI-100基因的短發(fā)夾結(jié)構(gòu)寡核苷酸，以及一對(duì)組成相同、序列無同源性的陰性對(duì)照，

2、分別退火成雙鏈DNA片段，與pGenesil-1質(zhì)粒連接，構(gòu)建表達(dá)shRNA的重組質(zhì)粒，用脂質(zhì)體2000分別轉(zhuǎn)染到K562細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)RT-PCR法和斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后K562細(xì)胞中CGI-100基因表達(dá)受抑的程度，選擇抑制率最高的細(xì)胞作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)，命名為K562/shRNA-CGI-100。 利用MTT、聯(lián)苯胺染色，流式細(xì)胞術(shù)、電鏡觀察等方法研究K562/shRNA-CGI-100細(xì)胞增殖、紅系分化、細(xì)胞周期與細(xì)胞超

3、微結(jié)構(gòu)的變化。用0.2mg/ml苦參堿作用K562/shRNA-CGI-100細(xì)胞與對(duì)照K562細(xì)胞（包括K562/shRNA-pGenesil細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，下同）后，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖狀態(tài)變化、聯(lián)苯胺染色檢測(cè)各組細(xì)胞的紅系分化情況、RT-PCR技術(shù)檢測(cè)紅系分化指標(biāo)GPA與Gfi-1B mRNA表達(dá)情況、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面分化抗原GPA（又稱CD235a）、CD14和CD15表達(dá)水平。用30μmol/L氯化高鐵血紅素

4、作用K562/shRNA-CGI-100細(xì)胞與對(duì)照K562細(xì)胞后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面分化抗原GPA表達(dá)水平。 結(jié)果：經(jīng)DNA測(cè)序證實(shí)3對(duì)靶向CGI-100基因的RNA干擾表達(dá)載體pGenesil-1-CGI-100與陰性對(duì)照載體pGenesil-1-Negative構(gòu)建成功。分別將上述3對(duì)干擾載體、陰性對(duì)照載體pGenesil-1-Negative與空載質(zhì)粒pGenesil-1轉(zhuǎn)染白血病K562細(xì)胞，經(jīng)G418抗性篩選后，熒

5、光倒置顯微鏡下可以觀察到細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白（EGFP）表達(dá)；RT-PCR與斑點(diǎn)雜交結(jié)果表明3對(duì)干擾載體均抑制了CGI-100 mRNA的表達(dá)，其中第1對(duì)pGenesil-1-CGI-100的抑制效率最高，達(dá)54％，將此重組細(xì)胞命名為K562/shRNA-CGI-100，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)象。而pGenesil-1-Negative質(zhì)粒與pGenesil-1質(zhì)粒對(duì)CGI-100 mRNA的表達(dá)無影響。 與對(duì)照K562細(xì)胞相比，K562

6、/shRNA-CGI-100細(xì)胞中CGI-100基因mRNA表達(dá)降低了54％；細(xì)胞常染色質(zhì)減少，異染色質(zhì)增加；MTT顯示細(xì)胞吸光度值下降23％（P<0.05）；細(xì)胞周期相分布明顯改變，G0/G1期細(xì)胞由21％增加到35％、S期細(xì)胞由56％減少到38％、增殖指數(shù)（PI）從78％降低到63％、聯(lián)苯胺染色陽性率從3％升高到7％（P<0.05）。0.2mg/ml苦參堿作用48h后，MTT顯示K562/shRNA-CGI-100細(xì)胞增殖抑制率從4

7、1％增高到62％（P<0.05），聯(lián)苯胺染色陽性率由16％升高到23％（P<0.05），紅系分化指標(biāo)GPA mRNA、Gfi-1B mRNA表達(dá)明顯增高（P<0.05）、流式細(xì)胞儀檢測(cè)紅系分化抗原GPA的MFI值增高了31％（P<0.05）；單核/巨噬細(xì)胞系分化指標(biāo)CD14在各組細(xì)胞均未表達(dá)、粒系分化指標(biāo)CD15雖有表達(dá)，但三種細(xì)胞之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。30μmol/L氯化高鐵血紅素分別處理K562/shRNA-CGI-10

8、0與對(duì)照K562細(xì)胞后，前者細(xì)胞表面GPA的MFI升高了20％（P<0.05），MFI值為1485，是0.2mg/ml苦參堿處理組的1.7倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論：成功構(gòu)建了針對(duì)CGI-100基因的RNA干擾表達(dá)載體，并篩選出1對(duì)抑制效率較高的重組干擾載體。CGI-100基因的低表達(dá)能抑制K562細(xì)胞增殖、使細(xì)胞幼稚程度減弱、使K562細(xì)胞向紅系分化的能力增強(qiáng)，并且增加了K562細(xì)胞對(duì)苦參堿和氯化高鐵血紅素