大蒜素對高糖環(huán)境人腎小管上皮細胞轉分化和凋亡的抑制作用及其機制研究.pdf

1、研究背景：
　　 糖尿病腎病是糖尿病常見和嚴重的慢性并發(fā)癥之一，也是導致終末期腎病的主要原因之一。糖尿病腎病的發(fā)病機制尚未完全闡明。近年研究表明，腎小管間質病變是糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的關鍵因素之一，進一步深入研究腎小管間質病變的分子機制、尋找有效治療的新靶點，對預防和延緩糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展有重要意義。
　　 腎小管間質纖維化的過程包括腎小管的萎縮和消失、肌成纖維細胞的聚積和細胞外基質的沉積。目前認為腎間質細胞外基質主要由

2、肌成纖維細胞產(chǎn)生，但有證據(jù)表明，在一些病理條件下，腎小管上皮細胞可發(fā)生上皮細胞-肌成纖維細胞轉分化，即腎小管上皮細胞喪失原有的上皮細胞表型特征，獲得肌成纖維細胞的表型，大量表達肌成纖維細胞的標志性蛋白α-平滑肌肌動蛋白和波形蛋白。已有眾多的研究表明，腎小管上皮細胞轉分化直接參與腎間質纖維化的進程，是腎間質纖維化發(fā)生、發(fā)展的的中心環(huán)節(jié)，已成為腎纖維化乃至慢性腎功能衰竭的重要機制之一。
　　 細胞凋亡與增殖的動態(tài)平衡是多細胞生物維系

3、結構完整和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的基本生物學特性。隨著對細胞凋亡的基因調(diào)控、信號轉導及其與疾病關系的深入研究，表明細胞凋亡密切參與了糖尿病腎病的發(fā)生機制。研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病腎病早期即出現(xiàn)腎小管上皮細胞的凋亡，后者是導致腎小管功能障礙的重要原因之一，也是糖尿病腎病進展為慢性腎功能衰竭的重要機制之一。有研究顯示，腎小管間質纖維化形成中存在明顯的腎小管上皮細胞凋亡現(xiàn)象，病變早期凋亡細胞數(shù)隨著腎間質纖維化的加重呈明顯增高趨勢。因此在糖尿病腎病致腎小管間質纖

4、維化的發(fā)生發(fā)展過程中，腎小管上皮細胞凋亡是高血糖損傷腎小管上皮細胞的重要病理變化形式之一。
　　 大蒜素，是大蒜的主要有效成分?，F(xiàn)代化學和藥理學研究發(fā)現(xiàn)大蒜素具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、降血脂、提高機體免疫力等多方面的作用。近年研究表明，大蒜素有抗肺、肝及心肌纖維化作用，主要與其抑制成纖維細胞增殖，抑制促纖維化因子的分泌及減少細胞外基質的合成等有關。
　　 研究目的：
　　 1.觀察大蒜素對高糖環(huán)境下人近端

5、腎小管上皮細胞轉分化的作用，并初步探討大蒜素抑制腎小管上皮細胞轉分化的機制。
　　 2.觀察大蒜素對高糖環(huán)境下人近端腎小管上皮細胞凋亡及凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax表達的影響，并初步探討大蒜素抑制腎小管上皮細胞凋亡的機制。
　　 實驗方法
　　 1.以人腎小管上皮細胞株HK-2細胞為研究對象，按實驗條件分為4組，以DMEM為培養(yǎng)基，即正常糖對照組、高糖組、大蒜素組和ERK抑制劑組，分別培養(yǎng)24h、48h。采用免

6、疫細胞化學法、熒光免疫細胞化學法檢測各組細胞內(nèi)α-SMA、Vimentin和Collagen I的相對表達量，Real-time PCR法檢測各組細胞內(nèi)TGF-β1 mRNA的相對表達，Western Blot法檢測各組細胞TGF-β1、p-ERKl/2蛋白的相對表達。
　　 2.以人腎小管上皮細胞株HK-2細胞為研究對象，按實驗條件分為3組，以DMEM為培養(yǎng)基，即正常糖對照組、高糖組和大蒜素組，細胞培養(yǎng)24h、48h。采用流式

7、細胞術觀察各組細胞的凋亡率，采用免疫細胞化學法檢測HK-2細胞內(nèi)Bcl-2和Bax蛋白的相對表達量。
　　 3.應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料用均數(shù)±標準差表示，各組間比較采用單因素方差分析，計數(shù)資料用率（％）表示，各組間比較采用x?檢驗，p<0.05有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 1.大蒜素對HK-2細胞形態(tài)學變化的影響
　　 正常糖對照組生長24h后，形成融合的單層細胞，呈橢

8、圓形或者多邊形貼壁細胞，生長48h后細胞間緊密連接，具有典型的上皮細胞鋪路石樣形態(tài)學特征。高糖組生長24h后，細胞形態(tài)改變不明顯，生長48h后，可見部分細胞發(fā)生明顯的形態(tài)學改變，表現(xiàn)為成纖維細胞樣外觀：細胞拉長、肥大，呈長梭形，由橢圓形貼壁生長變?yōu)殚L梭形，喪失其鋪路石樣生長方式。大蒜素組干預48小時后，細胞形態(tài)與N組無明顯差異，光鏡下多數(shù)細胞保持正常上皮，僅少數(shù)發(fā)生形態(tài)變化。PD98059組細胞生長48h后，受高糖刺激而出現(xiàn)的形態(tài)學改變

9、有一定程度的改善。
　　 2.大蒜素對HK-2細胞α-SMA、Vimentin、Collagen I表達的影響
　　 細胞培養(yǎng)48h，高糖組α-SMA、Vimentin、Collagen I表達的積分光密度值較正常糖對照組明顯增加，均有統(tǒng)計學意義；PD98059組α-SMA、Vimentin和Collagen I表達的IOD較高糖組均明顯減少，且與正常糖對照組無明顯差異；高糖環(huán)境下經(jīng)不同濃度的大蒜素干預后，α-SMA、V

10、imentin、Collagen I表達的IOD明顯下降，并呈濃度依賴性，尤以20ug/mL更為明顯，此組與正常糖對照組和PD98059組比較無顯著差別。
　　 3.大蒜素對HK-2細胞TGF-β1 mRNA表達的影響
　　 細胞培養(yǎng)48h時，與正常糖對照組比較，高糖組HK-2細胞TGF-β1 mRNA表達明顯上調(diào); PD98059組可逆轉高糖刺激下的TGF-β1 mRNA表達，但仍高于正常糖對照組；大蒜素可明顯下調(diào)高糖

11、刺激下HK-2細胞TGF-β1mRNA的表達，并呈濃度依賴效應，尤其在10ug/ml、20ug/ml時，同時與PD98059組比較無顯著性差異，且20ug/ml時與正常糖對照組比較亦無顯著性差異。
　　 4.大蒜素對HK-2細胞TGF-βl、p-ERK1/2蛋白表達的影響
　　 細胞培養(yǎng)48h時，正常糖對照組HK-2細胞可見少量TGF-β1、p-ERK l/2蛋白的表達；高糖組HK-2細胞TGF-β1、p-ERK l/2

12、的蛋白表達較正常糖對照組明顯上調(diào)；與高糖組比較，PD98059組TGF-β1、p-ERK l/2蛋白表達均明顯下調(diào)，而TGF-β1蛋白與正常糖對照組比較無顯著性差異；與高糖組比較，經(jīng)不同濃度大蒜素干預48小時后，HK-2細胞TGF-β1、p-ERKl/2蛋白的表達水平均呈藥物濃度依賴性下調(diào)，尤以20ug/mL濃度作用最強，抑制率分別為55.7％和37.7％，且與正常糖對照組比較，p-ERK l/2蛋白表達亦明顯下調(diào)，而TGF-β1蛋白表

13、達差異無顯著性，但兩者均仍高于PD98059組。
　　 5.大蒜素對HK-2細胞凋亡率的影響
　　 細胞培養(yǎng)24h，正常糖對照組只有少量細胞發(fā)生凋亡，凋亡率僅為（6.56±1.09）％，而高糖組凋亡率為（16.25±0.58）％，兩組間有顯著性差異；大蒜素干預組的細胞凋亡率分別為（12.54±2.21）％、（9.21±2.85）％、（8.53±2.15）％、（6.81±0.92）％，均較高糖組有明顯下降，且大蒜素濃度為5

14、、10、20ug/ml時與正常糖對照組比較無顯著性差異。細胞培養(yǎng)48h，正常糖對照組細胞亦只有少量細胞發(fā)生凋亡，凋亡率僅為（6.82±2.38）％，高糖組升高為（23.53±3.21）％；而大蒜素干預組的細胞凋亡率分別為（14.43+1.85）％、（11.68±3.20）％、（10.19±1.93）％、（7.99±2.00）％，與高糖組比較均有明顯下降，且大蒜素濃度為10、20ug/mL時與正常糖對照組比較無顯著性差異。
　　

15、6.大蒜素對HK-2細胞Bcl-2、Bax蛋白表達的影響
　　 細胞培養(yǎng)48h，高糖組Bcl-2蛋白表達的積分光密度值為（14.08±2.14），較正常糖對照組的IOD（31.97±4.29）明顯降低，不同濃度的大蒜素組的Bcl-2蛋白表達的IOD高于高糖組，并隨著濃度的增高而升高，但仍低于正常糖對照組；而Bax蛋白則正好相反，高糖組Bax蛋白表達的IOD為（109.83±14.13），較正常糖對照組的IOD（29.68±3.3

16、0）明顯升高，不同濃度大蒜素組的Bax蛋白表達的IOD明顯低于高糖組，并隨著濃度的增高而逐漸降低，但仍高于正常糖對照組。Bcl-2/Bax的比值在高糖組明顯低于正常糖對照組，經(jīng)大蒜素干預后其比值較高糖組有升高，并呈濃度依賴性，但仍明顯低于正常糖對照組（p<0.01）。
　　 結論：
　　 1.高糖可誘導HK-2細胞轉分化為肌成纖維細胞，上調(diào)TGF-β1和細胞外基質成分Collagen I的表達。
　　 2.ERK

17、l/2信號通路抑制劑PD98059可明顯抑制高糖環(huán)境下HK-2細胞的表型轉分化，下調(diào)TGF-β1和Collagen I的表達，阻斷ERK l/2信號通路是抑制TEMT、防治腎間質纖維化的重要干預靶點。
　　 3.大蒜素可通過抑制ERK l/2信號通路的激活而抑制高糖狀態(tài)下HK-2細胞向肌成纖維細胞轉分化，下調(diào)TGF-β1和Collagen I的表達，其抑制作用與PD98059相似。
　　 4.高糖誘導腎小管上皮細胞發(fā)生凋