前列腺癌基因表達譜芯片數(shù)據(jù)分析.pdf

1、前列腺癌(prostatecancer，PC)為全世界男性最常見的癌癥之一，在美國男性所有診斷出來的腫瘤當中PC占了1/3，病死率排第二，僅次于肺癌，近年來PC在中國的發(fā)病率也呈不斷上升趨勢。近年來，隨著分子生物學的迅速發(fā)展，人們對腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的細胞和分子水平的變化有了進一步的認識。癌的發(fā)生、發(fā)展是多基因改變的結(jié)果，在這過程中有多種原癌基因被激活以及抑癌基因失活，癌的發(fā)生、發(fā)展就是原癌基因、抑癌基因以及生長因子調(diào)控失調(diào)的結(jié)果，前列

2、腺癌的發(fā)生也不例外。但是前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程十分復(fù)雜，呈現(xiàn)多步驟、多基因復(fù)合的特點，目前人們對其涉及的機制還知之甚少?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，一開始前列腺癌細胞的生長有依賴雄激素的生物學特性，多數(shù)前列腺癌患者在首次接受雄激素剝奪療法后都有顯著療效，但最后超過一半的患者會復(fù)發(fā)并由雄激素依賴型前列腺癌發(fā)展成高度惡化且廣泛轉(zhuǎn)移的雄激素非依賴型前列腺癌，使常規(guī)的雄激素剝奪治療失去效果，而前列腺癌細胞激素依賴型發(fā)生變化，是腫瘤細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移和對抗內(nèi)雄激素剝奪治

3、療，從而導致臨床患者病情惡化并最終導致死亡的主要原因。前列腺癌形成的基因改變有不少報道，但對雄激素非依賴型前列腺癌的形成機制還不清楚且報道不多，基因芯片技術(shù)對PC在雄激素剝奪治療前后的基因表達改變分析也許對了解雄激素非依賴型前列腺癌的形成過程可以提供一些線索。本研究利用基因芯片數(shù)據(jù)分析軟件GeneSifter對來自基因表達數(shù)據(jù)庫GeneExpressionOmnibus(GEO)的12個雄激素依賴型前列腺癌和雄激素非依賴型前列腺癌基因表

4、達譜芯片數(shù)據(jù)作進一步生物信息學分析，以了解PC在雄激素剝奪治療后的基因表達變化，并進一步探討雄激素非依賴型前列腺癌形成的分子機理。 本文屬于基因芯片生物信息學的內(nèi)容，探索利用基因表達數(shù)據(jù)庫GEO所貯存的基因芯片表達數(shù)據(jù)并結(jié)合一些生物學知識對雄激素非依賴型前列腺癌形成機理作進一步推測分析，以期為闡明雄激素非依賴型前列腺癌形成的分子機制提供一些基因表達方面的線索，并為進一步的相關(guān)實驗研究提供參考。本研究按順序分三部分： 第一

5、部分：對基因芯片與數(shù)據(jù)分析作了綜述，先對基因芯片的基本原理、單通道和雙通道實驗、基因芯片的種類和應(yīng)用作了敘述；然后對基因芯片數(shù)據(jù)分析、數(shù)據(jù)的處理、實驗設(shè)計與平臺的選擇、差異基因表達、聚類分析和生物學意義分析作了敘述； 第二部分：詳細介紹了基因表達數(shù)據(jù)庫GEO的構(gòu)成、查詢和一些分析工具的使用?；蛐酒膹V泛應(yīng)用，產(chǎn)生了海量的數(shù)據(jù)，為基因研究提供大量高通量數(shù)據(jù)資料。為有效地組織、存取、管理如此大量的基因數(shù)據(jù)信息，迫切需要一個統(tǒng)一管理

6、的公共數(shù)據(jù)庫、建立一種通用的數(shù)據(jù)標準格式，使數(shù)據(jù)能更好地與其它信息資源比較分析。幾個實驗室和機構(gòu)開始試圖組建網(wǎng)上資源來散布這些高通量數(shù)據(jù)集，隸屬于美國國立衛(wèi)生研究院的NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)，開始了一個基因表達匯編計劃，即：基因表達綜合庫(GeneExpressionOmnibus，GEO)，以便更好的支持公共使用和散布基因表達數(shù)據(jù)。GEO數(shù)據(jù)庫創(chuàng)建于2000年，是當

7、今最大、最全面的公共基因表達數(shù)據(jù)資源，至今已存儲了214，268個樣本，8300個記錄，4500個平臺。GEO數(shù)據(jù)庫覆蓋廣泛的生物學內(nèi)容，包括疾病、代謝、藥理學、藥學、免疫學和生態(tài)學等。數(shù)據(jù)來自世界各地實驗室研究者的提交，有些雜志要求文章發(fā)表時將數(shù)據(jù)提交到一些公共數(shù)據(jù)庫，其目的是可以讓一些獨立的研究機構(gòu)來重新評價和分析這些數(shù)據(jù)的結(jié)果。GEO數(shù)據(jù)庫及其工具，也可以驗證實驗室的研究發(fā)現(xiàn)，或提供支持性意見，或設(shè)計研究計劃及其獲得假說的否定證據(jù)

8、等。GEO數(shù)據(jù)的再分析和重新解釋還可以為其它領(lǐng)域提供一些有價值的線索。隨著GEO數(shù)據(jù)庫在大小和多樣性方面的不斷增長，這樣的研究發(fā)現(xiàn)機遇也將不斷提高。 第三部分：應(yīng)用基因芯片數(shù)據(jù)分析工具GeneSifter對前列腺癌基因芯片數(shù)據(jù)進行了分析，發(fā)現(xiàn)一些差異表達的基因，并對這些差異表達基因進行基因本體和KEGG通路分析。前列腺癌抗雄激素治療后，前列腺癌由激素依賴型向激素非依賴型的轉(zhuǎn)化，這是困擾多年的問題。前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程包含多種分

9、子的改變，這些改變可以通過前列腺癌細胞基因表達的變化來反映。隨著現(xiàn)代分子生物學的發(fā)展，采用基因芯片技術(shù)分析腫瘤細胞在不同發(fā)展階段的基因調(diào)節(jié)，根據(jù)基因表達方式對腫瘤患者進行分類并實施個體化治療，是前列腺癌研究的方向。國際上諸多學者通過對前列腺癌基因表達譜的分析，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些新的前列腺癌異常表達基因，為前列腺癌分子標志物的最終判定及選擇相應(yīng)的靶序列進行基因治療奠定了基礎(chǔ)。本研究所用到的芯片數(shù)據(jù)平臺是GPL96，也稱人類基因組HG-U133

10、A芯片集，是艾菲公司(Affymetrix)的產(chǎn)品，它包含45000個探針集代表超過39000個轉(zhuǎn)錄本來源于大概33000個充分證實過的人類基因，至今在GEO數(shù)據(jù)庫已有15932個樣本使用這個平臺?；虮磉_譜芯片數(shù)據(jù)來自GEO公共數(shù)據(jù)庫由BESTCJ等提交的GDS1390數(shù)據(jù)集GSE2443系列20個樣品芯片數(shù)據(jù)中選取12個GSM，其編號分別是：GSM45850，GSM45851，GSM45852，GSM45853，GSM45854，G

11、SM45855，GSM45860，GSM45861，GSM45862，GSM45863，GSM45864，GSM45865。前6個數(shù)據(jù)的標本是雄激素依賴型前列腺癌患者于雄激素剝奪治療前行前列腺切除術(shù)取得并經(jīng)過病理學鑒定；后面6個數(shù)據(jù)的標本是雄激素非依賴型前列腺癌患者原位腫瘤活檢組織取得，所有標本經(jīng)處理后采用激光捕獲顯微切割(LCM)方法取得的細胞經(jīng)RNA提取、擴增、逆轉(zhuǎn)錄和熒光標記等步驟，最后與AffymetrixHumanGenome

12、U133A芯片雜交，經(jīng)AffymetrixGeneChipScanner3000掃描儀掃描得到原始數(shù)據(jù)上傳到GEO數(shù)據(jù)庫。從GeneSifter對雄激素依賴型前列腺癌和雄激素非依賴型前列腺癌兩組表達譜數(shù)據(jù)差異分析結(jié)果看，表達差異基因篩選得到348個基因中有108個基因表達上調(diào)，240個基因表達下調(diào)，其中有一些基因以前有文獻報道過與腫瘤有關(guān)，如Bcl-2、Tetraspanin1、GALNT12，其中表達最具顯著意義的是GREB1prot

13、ein基因，下調(diào)表達達到15.48倍，是表達倍數(shù)最高的基因，GREB1(generegulatedbyestrogeninbreastcancerl)是雌激素應(yīng)答基因，在乳腺癌研究中被認為在腫瘤對激素反應(yīng)中有重要的作用，此次發(fā)現(xiàn)在雄激素非依賴型前列腺癌中顯著低表達，提示其對前列腺癌在激素剝奪治療后可能也有重要的作用。通過GeneSifter自帶的GO生物學過程分析和KEGG通路分析，得到比較有意思的結(jié)果是在細胞黏附以及細胞通訊相關(guān)的基因

14、表達有顯著的變化，提示細胞黏附過程可能與前列腺癌相關(guān)。相鄰細胞間的連接決定細胞和組織的形態(tài)、調(diào)控細胞的運動、生長、分化和存活等。細胞間黏附連接結(jié)構(gòu)(adherenjunction)的形成是通過相鄰細胞表面的鈣依賴型鈣黏著素受體的細胞外區(qū)域的相互作用實現(xiàn)的，細胞的惡變通常表現(xiàn)為組織結(jié)構(gòu)中細胞骨架的根本改變，一方面通過下調(diào)鈣黏素或連環(huán)蛋白(catenin)家族成員的表達實現(xiàn)，另一方面可以通過激活一些可阻斷細胞間黏附連接結(jié)構(gòu)聚集的信號傳導途徑