IRAK1基因ShRNA質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定.pdf_第1頁
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文檔簡(jiǎn)介

1、目的：
　　 本研究采用含H1啟動(dòng)子的載體pGPU6/GFP/Neo，針對(duì)IRAK1基因的短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA（shRNA）構(gòu)建靶向IRAK1基因特異性shRNA真核表達(dá)載體，為今后體外或體內(nèi)研IRAK1基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性損傷后的功能修復(fù)提供一種有效方法。
　　 方法：
　　 根據(jù)pGPU6/GFP/Neo中H1啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)siRNA對(duì)序列的要求，利用Ambion公司在線siRNA Target find

2、er軟件（http：//www.ambion.com/techlib/misc/siRNA finder.html）設(shè)計(jì)合成shRNA序列。在PCR儀上按照如下程序進(jìn)行shRNA模板的退火處理：95℃ 5 min，85℃ 5 min，75℃ 5 min，70℃ 5 min，4℃保存。經(jīng)酶切處理，pGPU6/GFP/Neo載體的線性化及其構(gòu)建。所得質(zhì)粒用BamH I、Pst I分別酶切鑒定并測(cè)序。
　　 結(jié)果：
　　 成功

3、構(gòu)建shRNA真核表達(dá)載體模式。pGPU6/GFP/Neo分別為含抗性篩選標(biāo)記Neomycin同時(shí)可以表達(dá)GFP蛋白的RNAi載體，Kanamycin/Neo分別代表卡那抗性和新霉素抗性。pGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒載體用BamH I，Pst I分別酶切電泳鑒定，結(jié)果表明，所有質(zhì)粒均為陽性重組載體，即所設(shè)計(jì)的shRNA干擾片段確已插入到RNAi載體中。每組選擇兩個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序鑒定結(jié)果重組質(zhì)粒編碼序列插入位置正確，無基因突變，

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