綿羊Myostatin基因shRNA慢病毒載體的構建與鑒定.pdf

1、本研究的目的是構建綿羊myostatin基因 RNA干擾(RNAi)慢病毒載體，并評估其對myostatin基因表達的沉默效果。方法是，在Genebank中檢索目的基因的序列，獲得sheep的myostatin的序列，根據(jù)ambion的shRNA設計系統(tǒng)，設計、合成4對針對myostatin基因shRNA干擾載體。合成全基因序列，將合成好的全基因序列裝入pMD-18T載體并轉化至感受態(tài)細胞DH5a，測序驗證發(fā)現(xiàn)有突變點，通過重疊PCR將

2、基因序列中突變點修復，將突變后的全長片段用XhoI和EcoRI酶切后連接至目的載體pCDNA3.1(+)，并轉化到感受態(tài)細胞DH5a中，經測序驗證，重組克隆中插入片段序列與目的基因序列完全一致，高效表達載體構建成功。用Lipofeetamine2000將pcDNA3.1-Ovis aries MSTN質粒、shRNA 干擾載體共轉染至HEK293細胞,48h后取一部分細胞做qPCR，通過qPCR檢測細胞樣品中目的基因和內參基因的表達量，

3、采用△△Ct的方法進行相對定量，使用轉染陰性干擾載體的樣品作為對照樣品，比較各瞬時轉染干擾載體組樣品目的基因的表達，并計算干擾效果，shRNA-86C的干擾效果最好，基因沉默效率60.13％，對shRNA-86C進行慢病毒包裝。將雙鏈的shRNA oligo插入到shRNA表達載體pENTR?/U6 vector中，構建shRNA表達質粒，使用Invitrogen公司的LR重組系統(tǒng)將pENTR/U6-85-C與慢病毒載體pLenti6/

4、BLOCK-iT-DEST進行重組。用Lipofeetamine2000將構建的慢病毒表達載體 pL-85-C和包裝質粒（Packaging Mix）共轉染至生長狀態(tài)良好，處于對數(shù)生長期的293T細胞,48h后收集細胞培養(yǎng)上清,3000rpm 離心10 min，去除細胞和碎片，并用0.45um的濾器過濾，將病毒原液在50000g下超速離心2小時，去除上清，重懸于500 μl DMEM培養(yǎng)液中，病毒感染細胞HEK293細胞，在倒置顯微鏡下