基于細菌16S rRNA序列的中醫(yī)舌苔類型分析及其應(yīng)用.pdf

1、舌診是中醫(yī)診斷學(xué)的一個重要組成部分。該診斷方法根據(jù)舌苔的顏色、腐膩、厚薄程度等，將舌苔分為不同的類型，然后利用舌苔類型判斷病人的健康狀況。然而，舌苔的形成機制，如舌苔為什么會在不同健康狀況下發(fā)生變化，影響這些變化的關(guān)鍵因素是什么，目前仍未被闡明。已有研究表明，細菌在舌苔的形成中發(fā)揮了重要作用。因此，探討不同中醫(yī)舌苔類型的舌苔菌群結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，有助于更深入地揭示舌苔形成原理，促進中醫(yī)舌診的客觀化和標準化。另外，肺癌是我國主要的惡性腫瘤，

2、所以本課題主要以肺癌病人中醫(yī)舌苔類型和舌苔菌群結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系為研究對象。
　　 在采集了多例健康者（薄白苔）和具有不同中醫(yī)舌苔類型（薄白苔、白膩苔、黃膩苔，黃厚苔，薄灰黃膩苔）的肺癌病人的舌苔樣本之后，我們采用變性凝膠梯度電泳（DGGE）技術(shù)對樣本進行了分析與比較：提取每個樣本的舌苔細菌總DNA，PCR擴增細菌16S rRNA基因V3區(qū)，DGGE分離擴增產(chǎn)物，并利用Bionumerics軟件分析同一種中醫(yī)舌苔類型的不同個體間的舌

3、苔菌群結(jié)構(gòu)的組內(nèi)相似性，發(fā)現(xiàn)相同中醫(yī)舌苔類型的舌苔菌群結(jié)構(gòu)具有較高的相似性（43.2％-93.3％）。
　　 為了探明不同中醫(yī)舌苔類型的具體菌群結(jié)構(gòu)，我們又挑選了舌苔菌群結(jié)構(gòu)相似度較高的2例薄白苔肺癌病人的舌苔樣本和2例白膩苔肺癌病人的舌苔樣本，進行SOLiD高通量測序分析。SOLiD測序儀是新發(fā)展起來的一種通量高速度快（60G/run/6-7天）成本相對較低的測序儀，但該儀器測序閱讀長度只有35bp-70bp，因此到目前為止，

4、還未見采用該儀器測序16SrRNA基因的文章報導(dǎo)。我們首先提出多組PCR與SOLiD測序儀分析相結(jié)合的技術(shù)。在該技術(shù)中，我們從人類口腔微生物數(shù)據(jù)庫（Human Oral Microbiome Database，http：//www.homd.org/）中挑選了大量的16S rRNA基因序列，采用MEGA4.0.2軟件和Primer5.0軟件，針對不同菌群所特有保守區(qū)和可變區(qū)設(shè)計引物，共設(shè)計26對引物。并在每組引物前增加了限制性內(nèi)切酶Ec

5、o57I的酶切識別位點。PCR產(chǎn)物經(jīng)Eco57I酶切后，用T4聚合酶削平酶切產(chǎn)物的3’-末端，余4個引物堿基作為引物識別標簽。
　　 采用該技術(shù)，我們成功測序和分析了前面挑選出的4個樣本。其中，這4個樣本測序量為1.4G，共產(chǎn)生了42，647，004個reads。有398，703個reads與reference唯一匹配。我們把唯一匹配的數(shù)據(jù)進行舌苔菌群結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果表明，2例薄白苔肺癌病人的舌苔菌群結(jié)構(gòu)相似性較高，而2例白膩苔肺