16S rRNA基因熒光定量PCR-基因芯片雜交法的建立及其應(yīng)用研究.pdf

1、新生兒敗血癥(neonatalsepsis)發(fā)病隱匿，臨床癥狀無特異性，存活者有相當(dāng)一部分發(fā)生后遺癥。因此，尋找快速、敏感而特異的新生兒敗血癥早期診斷指標(biāo)，對(duì)指導(dǎo)臨床治療、降低新生兒死亡率、改善預(yù)后，具有十分重要的意義。在本研究中，分析細(xì)菌16SrRNA基因序列，在其保守區(qū)設(shè)計(jì)引物和探針，進(jìn)行熒光定量PCR與基因芯片雜交分析，最終建立了細(xì)菌16SrRNA基因熒光定量PCR與基因芯片雜交相結(jié)合的方法快速檢測(cè)細(xì)菌DNA，并對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)

2、取得良好效果。本研究分二部分： 第一部分16SrRNA基因熒光定量PCR—基因芯片雜交技術(shù)的建立方法： 在細(xì)菌的16SrRNA基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)通用引物，并在該引物的擴(kuò)增的區(qū)域內(nèi)設(shè)定一條通用熒光探針。對(duì)陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株組、陰性對(duì)照組進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)、分析。同時(shí)在細(xì)菌16rRNA基因保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，設(shè)置區(qū)分革蘭氏陰性菌、陽性菌與其他特異性菌屬的探針，制成基因芯片，通過對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株、陰性對(duì)照組進(jìn)行芯片熒光雜交、洗脫、掃描，最后

3、進(jìn)行分析。 結(jié)論:FQ-PCR檢測(cè)靈敏度高；耗時(shí)少；不受標(biāo)本中存在抗菌藥物或其他抑菌物質(zhì)的干擾；定量分析準(zhǔn)確，有助于評(píng)價(jià)治療效果、判斷預(yù)后，有效解決了PCR污染問題。基因芯片其雜交敏感性高，能檢出特殊培養(yǎng)，難以培養(yǎng)等細(xì)菌；可檢測(cè)任何無菌體液，如血、腦脊液、胸水等；最快4小時(shí)檢測(cè)，具有高通量性，多種項(xiàng)目可一次檢測(cè)。此項(xiàng)復(fù)合方法可為細(xì)菌感染的早期、快速診斷提供新的有效手段。 第二部分16SrRNA基因熒光定量PCR—基因芯片

4、雜交技術(shù)的臨床應(yīng)用研究方法： 本院新生兒、重癥監(jiān)護(hù)室(ICU)、15病區(qū)綜合病房臨床擬診為化膿性腦膜炎的住院患兒標(biāo)本49例，每例均抽取腦脊液2ml，其中1ml作腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)，1ml作細(xì)菌DNAFQ-PCR測(cè)定及芯片雜交。同時(shí)對(duì)臨床疑為敗血癥的住院患兒830例標(biāo)本，每例抽取靜脈血各1ml分別行血培養(yǎng)和細(xì)菌16SrRNA基因FQ-PCR—基因芯片雜交檢測(cè)。 結(jié)論：熒光定量PCR陽性的標(biāo)本其基因芯片雜交結(jié)果與血液培養(yǎng)結(jié)果基本