膽堿和蛋氨酸對奶牛圍產(chǎn)期營養(yǎng)平衡和機體健康的影響及機制.pdf

1、化，極值多出現(xiàn)于第0和7d，此時奶牛體脂動員最為嚴重，神經(jīng)內(nèi)分泌顯著改變，肝臟功能和機體健康均明顯下降。上述結(jié)果表明，圍產(chǎn)期奶牛NEL、MP和MG的負平衡均出現(xiàn)于圍產(chǎn)后期，但圍產(chǎn)前期奶牛生理代謝參數(shù)、器官功能和機體健康已發(fā)生改變，可見奶牛圍產(chǎn)期營養(yǎng)調(diào)控應(yīng)從圍產(chǎn)前期開始。
　　試驗2.過瘤胃膽堿和過瘤胃蛋氨酸對奶牛圍產(chǎn)期能量平衡和健康的影響
　　本試驗旨在研究日糧添加RPC（15g/d，以氯化膽堿計）和RPM（15g/d，以D

2、L-Met計）對奶牛圍產(chǎn)期能量平衡和機體健康的影響，選取48頭健康、經(jīng)產(chǎn)的中國荷斯坦奶牛，采用2×2因子試驗設(shè)計，按配對設(shè)計原則分為4組，每組12頭奶牛，分別為對照組（基礎(chǔ)日糧）、基礎(chǔ)日糧+RPC、基礎(chǔ)日糧+RPM和基礎(chǔ)日糧+RPC+RPM。基礎(chǔ)日糧同試驗1，干奶后即開始預(yù)飼圍產(chǎn)前期日糧，分娩后轉(zhuǎn)入泌乳日糧，試驗期為整個圍產(chǎn)期(-21d至21d)，評價相關(guān)指標。結(jié)果顯示，日糧添加RPC提高了奶牛產(chǎn)后第14d的采食量，RPM對采食量無影響

3、，RPC和RPM均可促進奶牛圍產(chǎn)后期的能量平衡(EB)，而對產(chǎn)前EB無影響;RPC和RPM均可降低血漿NEFA和β-羥基丁酸(BHBA)含量，并提高血漿葡萄糖和極低密度脂蛋白(VLDL)含量;RPC提高了奶牛肝臟活力指數(shù)(LAI)和肝臟功能指數(shù)(LFI)，RPM亦具有提高LFI的趨勢，RPC和RPM均具有提高修正的定量胰島素敏感檢測指數(shù)(RQUICKI)的趨勢;日糧添加RPC和RPM提高了血漿總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽過氧化物

4、酶(GSH-Px)活性和維生素E的含量及外周血T淋巴細胞亞群比例(CD4+/CD8+)，并降低了血漿丙二醛(MDA)、白細胞介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的含量。研究表明，日糧添加RPC和RPM可緩解奶牛圍產(chǎn)期能量負平衡，改善肝臟功能，促進機體健康。綜合上述和其它評價指標（詳見第三章），RPC在調(diào)控奶牛圍產(chǎn)期能量平衡方面更有優(yōu)勢。
　　試驗3.過瘤胃膽堿和過瘤胃蛋氨酸對奶牛圍產(chǎn)期蛋白質(zhì)平衡、氨基酸代謝和產(chǎn)后泌乳性

5、能的影響
　　本試驗旨在探究RPC和RPM對奶牛圍產(chǎn)期機體蛋白質(zhì)平衡、氨基酸代謝和產(chǎn)后泌乳性能的影響，試驗設(shè)計和奶牛飼養(yǎng)管理均同試驗2。研究發(fā)現(xiàn)，RPM具有促進奶牛圍產(chǎn)期全期機體MP平衡的趨勢，RPC不影響全期MP平衡，但RPC和RPM均具有提高產(chǎn)后第14d MP平衡的趨勢;RPC和RPM均顯著降低了血漿3-甲基組氨酸(3-MH)的含量，RPM還降低了血漿尿素氮(PUN)含量，RPC對PUN無影響;RPC和RPM均提高或趨于提高奶

6、牛血漿總氨基酸(TAA)、總必需氨基酸（TEAA）、蛋氨酸(Met)、亮氨酸(Leu)和?；撬?Tau)的含量;添加RPC和RPM提高了奶牛泌乳早期4％乳脂校正乳產(chǎn)量(4％FCM，對照組、RPC組、RPM組和RPC+RPM組分別為22.70、23.42、23.31和23.94kg/d)和乳脂率，RPM可提高乳蛋白率，而RPC對乳蛋白的影響不顯著，僅在數(shù)值上有所提高;RPM提高了乳中組氨酸(His)含量，并具有提高Met含量的趨勢，RPC

7、具有提高乳中His含量的趨勢，但不影響Met含量。以上結(jié)果表明，日糧添加RPC和RPM可減少機體蛋白質(zhì)動員，促進蛋白質(zhì)平衡，并調(diào)控機體氨基酸代謝，提高
　　營養(yǎng)素負平衡是奶牛圍產(chǎn)期（產(chǎn)前21d-產(chǎn)后21d）的典型生理特征，為滿足機體營養(yǎng)需要，奶牛大量動員體組織的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和其它營養(yǎng)素。機體營養(yǎng)素的大量動員易造成一系列代謝性疾病，如酮病和脂肪肝，并誘發(fā)肝臟和其它器官的氧化應(yīng)激及免疫抑制，降低肝臟功能和機體健康。膽堿和蛋氨酸(Met

8、)因其在奶牛肝臟一碳單位循環(huán)、脂質(zhì)氧化和轉(zhuǎn)運及機體健康方面的益生功效，已受到關(guān)注。目前，現(xiàn)有研究仍存不足:(1)奶牛圍產(chǎn)期營養(yǎng)平衡和營養(yǎng)生理的變化規(guī)律尚未完全理清，評價指標不系統(tǒng)不準確;(2)添加過瘤胃膽堿(RPC)和過瘤胃蛋氨酸（RPM）時，不考慮基礎(chǔ)日糧蛋白質(zhì)含量，且研究深度不夠，缺乏多指標、多層次的系統(tǒng)性探究;(3)膽堿和蛋氨酸調(diào)控肝細胞能量和脂質(zhì)代謝的信號通路尚不明確。基于以上問題，本研究在評價圍產(chǎn)期奶牛機體營養(yǎng)平衡和生理參數(shù)的

9、動態(tài)變化（試驗1）的基礎(chǔ)上，從能量代謝和機體健康(試驗2)、蛋白質(zhì)平衡和產(chǎn)后泌乳性能（試驗3）及新生犢牛體尺參數(shù)和營養(yǎng)生理（試驗4）多個方面，綜合研究RPC和RPM對奶牛圍產(chǎn)期營養(yǎng)代謝的調(diào)控，并以非酯化脂肪酸(NEFA)刺激構(gòu)建LO2肝細胞模型（試驗5），探究膽堿和蛋氨酸調(diào)控肝細胞脂質(zhì)和能量代謝的關(guān)鍵信號通路和調(diào)節(jié)因子（試驗6），為RPC和RPM在圍產(chǎn)期奶牛上的應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。
　　試驗1.奶牛圍產(chǎn)期營養(yǎng)平衡的評估及血

10、液代謝參數(shù)的動態(tài)變化
　　為明確奶牛圍產(chǎn)期機體營養(yǎng)平衡和營養(yǎng)生理參數(shù)的動態(tài)變化，為后續(xù)試驗和營養(yǎng)實踐提供基礎(chǔ)資料，本試驗選取14頭健康經(jīng)產(chǎn)的中國荷斯坦奶牛，整個干奶期采食同一日糧（1.51Mcal/kg NEL和11.92％CP，干物質(zhì)基礎(chǔ)，下同），分娩后轉(zhuǎn)入泌乳日糧(1.69Mcal/kg NEL和15.02％CP)。日糧瘤胃可降解淀粉(RDS)分別為20.17％和18.06％，物理有效中性洗滌纖維(peNDF)分別為peNDF

11、1.18=28.71％和24.24％及peNDF8.0=18.58％和16.60％，因此日糧碳水化合物平衡指數(shù)(CBI=peNDF/RDS)分別為CBI1.18=1.42和1.34及CBI8.0=0.92和0.92。干奶前期為日糧適應(yīng)期，正試期為整個圍產(chǎn)期，即干奶后期（圍產(chǎn)前期）和泌乳早期（圍產(chǎn)后期），共42d，每天或每周采集相關(guān)樣品，進行實驗室分析、計算和模型預(yù)測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，圍產(chǎn)前期奶牛機體泌乳凈能(NEL)、代謝蛋白質(zhì)(MP)和代謝

12、葡萄糖(MG)均不存在負平衡，而分娩后均出現(xiàn)負平衡，且產(chǎn)后第7d負平衡最為嚴重，NEL、MP和MG的缺乏量分別為5.76Mcal/d、254.42g/d和387.54g/d;隨分娩的臨近，奶牛DM、NEL、MP和MG攝入量均下降，分娩當天(0d)達到最低，較第-21d分別下降39.27％、39.30％、39.45％和32.82％，分娩后逐漸回升;從-21d到21d，奶牛血液生理代謝參數(shù)和相關(guān)綜合指數(shù)均呈現(xiàn)不同程度的二次益線變產(chǎn)后泌乳性能

13、，且RPM對奶牛氨基酸代謝的調(diào)控效應(yīng)優(yōu)于RPC。
　　試驗4.圍產(chǎn)前期添加過瘤胃膽堿和蛋氨酸對新生犢牛體尺指標和血液參數(shù)的影響
　　為確定圍產(chǎn)前期奶牛日糧添加RPC和RPM對胚胎生長發(fā)育、營養(yǎng)生理和機體健康的影響，在試驗2和3的基礎(chǔ)上，檢測新生犢牛體尺重及血液理代謝、肝臟新生犢牛體尺重及血液理代謝、肝臟功能、抗氧化和免疫狀態(tài)等指標。圍產(chǎn)前期試驗設(shè)計和飼養(yǎng)管理均同試驗2，犢牛出生后立即稱量體重，測量體尺，頸靜脈采血，測定相關(guān)指

14、標。結(jié)果表明，除RPC增加尻寬，以及RPM增加腰角寬外，RPC和RPM對犢牛初生重和其它體尺指標、指數(shù)均無影響;RPC具有提高新生犢牛血糖的趨勢，RPM則具有提高PUN的趨勢，而血漿NEFA、BHBA、VLDL和3-MH含量均無顯著變化;RPM提高了新生犢牛血漿Met和半胱氨酸(Cys)濃度，并具有提高Tau濃度的趨勢;RPC亦趨于提高血漿Met和Cys濃度，但不影響Tau濃度;RPC和RPM均提高或趨于提高血漿胰島素樣生長因子1(IG

15、F-1)含量，但對其它內(nèi)分泌指標均無影響;RPC降低了血漿TNF-α含量，并具有提高血漿T-AOC和外周血T淋巴細胞CD4+/CD8+的趨勢;RPM具有提高血漿T-AOC和降低TNF-α的趨勢，但對CD4+/CD8+無影響?？梢姡琑PC和RPM可不同程度影響新生犢牛蛋白質(zhì)和氨基酸代謝，提高血漿部分氨基酸及葡萄糖和IGF-1含量，并改善機體抗氧化和免疫功能，這些變化對犢牛生長發(fā)育的后續(xù)影響有待進一步研究。
　　試驗5.NEFA和BH

16、BA對肝細胞能量和脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響
　　本試驗以LO2肝細胞為試驗對象，研究BHBA和NEFA對肝細胞能量和脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響，在此基礎(chǔ)上，為后續(xù)研究建立細胞模型。首先，設(shè)計不同濃度梯度，BHBA和NEFA的梯度均為0、0.5、1.0、1.5、2.0和4.0mmol/L，每濃度6重復(fù)，細胞處理時間均為24h，以細胞增殖、氧化還原參數(shù)及腺苷一磷酸激活的蛋白激酶α(AMPKα)和TNF-α的表達量為評

17、價指標。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨BHBA和NEFA濃度的升高，細胞增殖、抗氧化能力和AMPKα表達量逐漸降低，TNF-α表達量逐漸升高;根據(jù)研究需求綜合考量，最終確定BHBA和NEFA后續(xù)試驗濃度均為1.5mmol/L。其次，試驗設(shè)4個處理，分別為對照組、BHBA組、NEFA組和混合添加組，每組6個重復(fù)，處理時間為24h，測定相關(guān)指標，研究表明，BHBA和NEFA均不同程度影響AMPKα、肝臟X受體α(LXRα)、過氧化物酶體增殖激活受體α（PPA

18、Rα）、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c（SREBP-1c）等調(diào)節(jié)因子的表達，進而抑制肝細胞脂肪酸氧化、合成和轉(zhuǎn)運等靶基因的表達;BHBA和NEFA均抑制肝細胞紅系衍生的核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子2(Nrf2)抗氧化通路，并激活核因子κB(NF-κB)炎癥通路。研究表明，較高濃度(1.5mmol/L)的BHBA和NEFA均可抑制肝細胞能量和脂質(zhì)代謝，并降低抗氧化能力，誘導細胞炎癥反應(yīng)。NEFA1.5mmol/L可用于構(gòu)建肝細胞模型，以模擬體脂動員時肝細胞的

19、生存環(huán)境。
　　試驗6.膽堿和蛋氨酸對NEFA肝細胞模型能量和脂質(zhì)代謝的調(diào)控
　　在前期動物試驗和細胞模型基礎(chǔ)上，本試驗旨在研究膽堿（氯化膽堿，下同）和Met對NEFA肝細胞模型能量和脂質(zhì)代謝關(guān)鍵基因和蛋白表達的影響，并確證AMPKα信號通路在這一過程中的作用。為精準控制培養(yǎng)基中膽堿和蛋氨酸含量，本試驗采用無膽堿無蛋氨酸的定制培養(yǎng)基，施加處理前，細胞在無血清的定制培養(yǎng)基中饑餓6h。經(jīng)篩選，膽堿和Met的適宜濃度分別為50和3

20、00μmol/L，設(shè)空白對照組(無膽堿無Met)、膽堿組（50μmol/L）、Met組（300μmol/L）和混合添加組(50μmol/L膽堿+300μmol/LMet);后續(xù)試驗中，在培養(yǎng)基中加入AMPKα抑制劑BML-275(10μmol/L)，每個處理均設(shè)6個重復(fù)，處理時間24h，測定相關(guān)生化指標及基因和蛋白的表達量。研究發(fā)現(xiàn)，膽堿和Met可提高AMPKα蛋白的磷酸化水平(p-AMPKα/AMPKα)，提高PPARα基因和蛋白的表

21、達量，降低LXRα和SREBP-1c基因和蛋白的表達量，進而改變下游靶基因的表達量，促進脂肪酸氧化和載脂蛋白合成關(guān)鍵基因的表達，抑制脂肪酸和酮體生成相關(guān)基因的表達;膽堿和Met均可增強細胞抗氧化能力，激活Nrf2抗氧化通路，降低TNF-α基因和蛋白的表達量;當加入BML-275時，肝細胞p-AMPKα/AMPKα顯著下降，此時膽堿和Met對肝細胞能量和脂質(zhì)代謝相關(guān)調(diào)節(jié)因子及其靶基因的調(diào)控效應(yīng)明顯下降。以上結(jié)果表明，膽堿和Met可通過調(diào)控

22、AMPKα通路及一些調(diào)節(jié)因子(LXRα、PPARα和SREBP-1c)的表達，調(diào)控肝細胞能量和脂質(zhì)代謝，促進肝細胞脂肪酸氧化和載脂蛋白合成，抑制脂肪酸合成和酮體產(chǎn)生。此外，膽堿和Met還可改善肝細胞氧化還原狀態(tài)，減少氧化和炎性損傷。
　　本研究表明，膽堿和Met可通過激活肝細胞AMPKα信號通路和調(diào)節(jié)LXRα、PPARα和SREBP-1c等因子的表達，調(diào)控肝細胞能量和脂質(zhì)代謝，減少脂質(zhì)蓄積，并通過Nrf2和NF-κB通路降低NEF