角膜緣干細胞自體移植的實驗研究.pdf

1、背景與目的：在眼表干細胞損傷疾病的治療中，角膜緣干細胞移植(limbal stem celltransplantanion，LSCT)已經(jīng)被確定為修補角膜緣組織缺損，補充角膜緣干細胞種群，治療角膜緣干細胞缺損(limbal stem cell deficiency，LSCD)和重建眼表結(jié)構(gòu)極為有效的方法。自體角膜緣干細胞移植(autograft)不存在免疫排斥反應(yīng)，移植成活率高。對于單眼部分干細胞缺損的患者，從健康眼表取多大范圍的角膜緣

2、干細胞組織才能保證其自然愈合不受損傷，仍然是一個值得探討的問題。纖維蛋白粘合劑(fibrin sealant，F(xiàn)S)作為一種新型的生物材料，已經(jīng)證明有止血和粘合組織的作用，無毒、無致癌、無致突變和致畸形作用，具有良好的生物相容性及生物降解性，不易引起炎癥、異物反應(yīng)、組織壞死等，在眼科手術(shù)中也有廣闊的應(yīng)用前景。本試驗首先連續(xù)遞增地切除不同范圍兔眼角膜緣干細胞組織，通過眼表裂隙燈顯微鏡觀察，角膜上皮印跡細胞學觀察及組織病理學觀察，確定角膜緣

3、干細胞移植時健眼取材的安全范圍。并且通過角膜組織病理、透射電鏡觀察和免疫組化方法探討FS行無縫線角膜緣干細胞移植治療LSCD的可行性，為臨床應(yīng)用奠定實驗基礎(chǔ)。 方法： 1．按30°、60°、90°等依次遞增至210°，分組切除兔眼角膜緣干細胞組織建立模型。 2．通過裂隙燈顯微鏡觀察各組角膜混濁、上皮熒光染色及角膜新生血管3項臨床指標，角膜上皮印跡細胞學檢查及HE染色觀察角膜上皮的細胞表型和組織病理學變化，確定角膜

4、緣干細胞健眼取材的安全范圍。 3．建立兔眼角膜緣干細胞部分缺損模型，并隨機分為纖維蛋白粘合劑組和常規(guī)縫線組對兔眼行白體角膜緣干細胞移植。手術(shù)三天后每天行角膜熒光素染色觀察兩組兔眼角膜上皮愈合時間；術(shù)后7天、14天、30天通過裂隙燈顯微鏡觀察角膜混濁和新生血管生長情況。 4．術(shù)后14、30天裂隙燈顯微鏡觀察兩組兔供眼角膜混濁、上皮熒光素染色及角膜新生血管情況。 5．通過HE染色光鏡觀察術(shù)后7天、14天、30天三個時

5、間點FS組和縫線組兔眼角膜組織病理變化。通過免疫組織化學方法觀察兩組角膜上皮特異性角蛋白K3以及P63蛋白的表達。移植術(shù)后30天，透射電鏡觀察角膜的超微結(jié)構(gòu)變化。 結(jié)果： 1．兔眼角膜緣切除范圍大于150°時，角膜出現(xiàn)混濁、上皮持續(xù)缺損、新生血管長入及結(jié)膜上皮向角膜內(nèi)生長等干細胞失代償表現(xiàn)，臨床指標評分比較有顯著差異(P=0.000<0.01)。 2．在出現(xiàn)角膜緣干細胞失代償?shù)耐醚劢悄ど掀び≯E細胞學檢查中，可見P

6、AS染色陽性的結(jié)膜杯狀細胞。 3．FS組角膜上皮愈合時間比縫線組短(P=0.044<0.05)，F(xiàn)S組在刺激角膜新生血管方面明顯輕于縫線組，有統(tǒng)計學差異(P=0.043<0.05)。 4．移植術(shù)后7天，F(xiàn)S組和縫線組角蛋白K3表達明顯低于正常對照組(P<0.01)，F(xiàn)S組角蛋白K3表達的10D值高于縫線組(P<0.05)，而術(shù)后30天FS組和縫線組與正常角膜間未見統(tǒng)計學差異(P>0.05)。 5．術(shù)后7天、14天

7、、30天，F(xiàn)S組與縫線組角膜P63蛋白表達量明顯增加，與正常兔眼角膜P63蛋白表達的IOD值比較均有非常顯著的差異(P<0.01)，而FS組與縫線組之間P63蛋白表達的IOD值未見統(tǒng)計學差異(P>0.05)。 結(jié)論： 1．角膜緣干細胞組織移植健眼的取材范圍≤150°(相當于5個鐘點位)是安全的。角膜緣干細胞切取范圍>150°可能出現(xiàn)不可逆的角膜緣干細胞失代償。 2. 纖維蛋白粘合劑行無縫線自體角膜緣干細胞組織移植