循環(huán)牽張應力對大鼠許旺細胞增殖與表達的影響.pdf

1、目的：通過體外構建許旺細胞循環(huán)牽張力學模型，對體外培養(yǎng)的許旺細胞實施循環(huán)牽張應力刺激模擬載體神經(jīng)的緩慢牽張，探索循環(huán)牽張應變刺激對周圍神經(jīng)來源許旺細胞增殖以及mRNA表達的影響，從細胞生物力學以及分子生物學角度探討肢體延長中的神經(jīng)生長延長機制。
　　方法：
　　1.體外平面循環(huán)牽張應力加載模型的建立：將硅橡膠材料制作成0.1 cm厚的透明薄膜，結合硅橡膠材料的泊松比以及彈性模量，應用三維有限元分析軟件對數(shù)據(jù)進行處理，模擬硅橡

2、膠受到牽張應變后產(chǎn)生的形變；通過MTT方法比較細胞在硅橡膠和標準培養(yǎng)板上的生長情況，并采取體外皮下包埋實驗驗證硅橡膠材料是否具有生物學毒性。
　　2.許旺細胞的純化：分離新生6d的Wista大鼠雙側(cè)坐骨神經(jīng)，雙酶消化法分離許旺細胞，用S-100免疫細胞化學染色方法對許旺細胞進行鑒定。將收集到的細胞分為3組，分別應用冷噴注法、改良冷噴注法和酶消化法對細胞進行純化，純化后的細胞分別計算純度，流式細胞儀測定細胞活性，并從細胞純度、細胞活

3、性、純化后所得細胞數(shù)量三個方面對許旺細胞的純化方法進行評估，從而尋找最佳的許旺細胞純化方法。
　　3.循環(huán)牽張應變刺激加載：體外培養(yǎng)6d齡大鼠許旺細胞并傳至P3代，按照刺激強度分為0、5％和10％形變組，利用ElectroForce3200力學試驗儀搭載的BioDynamic生物反應艙系統(tǒng)，以6h為固定時間點對細胞進行頻率為0.25Hz的周期性牽張應力刺激。觀察細胞形態(tài)學變化，流式細胞術檢測不同應力刺激下許旺細胞的增殖率，獲得許旺

4、細胞增殖的最佳應力值，并分為無力學刺激組和力學刺激組2組。Trizol分別提取細胞mRNA，采用高通量技術分析實驗組與對照組細胞基因表達譜差異，并采用聚類分析、GO分析等對實驗結果進行分析整理。
　　結果：
　　1.本課題組自制的硅橡膠細胞載體表面應力分布均勻，有效應變面積分布大，生物學相容性尚可，在BioDynamic細胞應力加載系統(tǒng)的配合下，可滿足許旺細胞的牽張刺激的實驗。
　　2.相比冷噴注法和差速酶消化兩種方法

5、而言，改良冷噴注法提純許旺細胞存在操作簡便，獲得許旺細胞純度高、不影響細胞活性等優(yōu)點，缺點是對操作者實驗操作技術和經(jīng)驗要求相對較高，初學者不易掌握，需在多次實踐中摸索掌握，但不失為一種可供參考的許旺細胞純化新方法，適合在本實驗中繼續(xù)使用。
　　3.在5％的應變刺激下，許旺細胞的S期細胞比例和增殖指數(shù)(PI)相比無應變刺激時有所升高，然而15％的應變刺激下，兩指標同時降低；光學顯微鏡下可見許旺細胞表現(xiàn)出明顯的形態(tài)學變化。比較實驗組與