周期性張應(yīng)力對大鼠生長板軟骨細胞的增殖和凋亡作用.pdf

1、目的：
　　1.探討不同強度下張應(yīng)力對生長板軟骨細胞的作用，對增值和凋亡的影響。并初步研究周期性張應(yīng)力對生長板軟骨細胞Hippo信號通路的影響。
　　2.檢驗大鼠跑臺裝置造大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型，同時于對照組給予口服環(huán)孢素A觀察藥物干預組能否改善骨關(guān)節(jié)炎病變的程度。檢測凋亡相關(guān)基因及蛋白的變化
　　3.建立大鼠運動動物模型，觀察不同強度的運動量對生長板軟骨的影響。
　　方法：
　　1.取大鼠生長板軟骨細胞的分離培

2、養(yǎng)，采用四點彎曲張力儀給予生長板軟骨細胞不同強度應(yīng)力刺激。用Annexxin V-FITC/PI染色免疫熒光觀察細胞凋亡，并行流式細胞學檢測細胞凋亡。行.Real-time PCR和Western blot檢測增殖和凋亡相關(guān)基因的表達和蛋白的變化。
　　2.采用大鼠跑臺建立骨關(guān)節(jié)炎模型并同時設(shè)組給予免疫抑制劑 CSA干預，用 MR和microCT檢測和評估骨關(guān)節(jié)炎模型，HE切片觀察骨關(guān)節(jié)炎改變，Real-time PCR檢測骨關(guān)節(jié)

3、炎相關(guān)基因的表達，Western blot檢測骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)蛋白的表達。
　　3.采用大鼠跑臺建立大鼠運動增殖模型，用microCT檢測運動模型并用HE切片觀察軟骨增殖改變。行Real-time PCR和Western blot檢測增殖相關(guān)基因的表達和蛋白的變化。
　　結(jié)果：
　　1.在較低的力學強度（2000μ）下生長板軟骨細胞軟骨細胞表達COL2基因以及COL2和SOX9蛋白表達量明顯增加，而RUNX2基因和蛋白表達

4、增加不明顯。中等力學強度時(3000μ、4000μ)，生長板軟骨細胞RUNX基因和蛋白的表達量明顯增加，而COL2基因以及COL2和SOX9蛋白表達量較未刺激細胞相比減少。在很高的力學強度刺激時（5000μ、6000μ）細胞MMP13及caspase9的基因表達上調(diào)，同時活化的caspase9蛋白表達量也增加。起保護作用的BCL2蛋白表達明顯減少。隨著應(yīng)力刺激強度的不斷增加，生長板軟骨細胞凋亡不斷增加。同時檢測出在增殖和凋亡時 YAP基

5、因和蛋白的高表達。
　　2.高強度的跑臺運動（大于30km）模型動物可檢測出影像學早期的骨關(guān)節(jié)炎改變，HE切片測量軟骨厚度減少，CASPASE9、MMP13、COL2、SOX9基因上調(diào)，活化CASPASE9蛋白表達增加，COL2、SOX9以及BCL2蛋白表達減少。CSA可減輕OA影像學表現(xiàn)，減輕骨關(guān)節(jié)炎程度。同時可降低凋亡相關(guān)蛋白的表達。
　　3.運動可以增加 Ki67基因的表達量以及 PCNA的基因和蛋白的表達量，并同時上

6、調(diào)SOX9基因的表達和增加SOX9和COL2蛋白的表達量，
　　結(jié)論：
　　1.較低的力學強度（2000μ）下生長板軟骨細胞分化主要以軟骨增殖趨勢為主。而中等力學強度時(3000μ、4000μ)，生長板軟骨細胞主要以成骨分化趨勢為主。很高的力學強度刺激時（5000μ、6000μ）細胞凋亡明顯增加。生長板軟骨細胞的增殖和凋亡可能與YAP的表達相關(guān)。
　　2.高強度的跑臺運動（大于30km）可通過增加關(guān)節(jié)軟骨機械應(yīng)力導致大