ERα和ERβ在調控青少年椎體生長板軟骨細胞分化和增殖中的相互作用.pdf

1、目的:
　　初步探索ERα和ERβ基因在青春期椎體生長板軟骨細胞分化和增殖中相互作用，以及Smad4基因在ERα和ERβ調控軟骨細胞Runx2和BMP基因表達過程中的信號傳遞作用。
　　方法:
　　應用genbank數據庫檢索小鼠ERα、ERβ和Smad4的cDNA序列及其轉錄本。設計針對ERα、ERβ和Smad4 mRNA打靶的siRNA序列，構建基因沉默慢病毒載體并包裝成為慢病毒顆粒。以小鼠椎體生長板軟骨細胞為對象

2、，首先分別轉染ERα-shRNA-PLL3.7、ERβ-shRNA-PLL3.7、ERα-shRNA-PLL3.7+ERβ-shRNA-PLL3.7慢病毒顆粒和空白對照組研究ERα和ERβ所在軟骨細胞的增殖、分化過程中的調控作用。然后采用分層設計的方法進行分組，分別轉染目的基因RNAi載體，研究Smad4基因在椎板軟骨細胞中介導ERα和ERβ調控Runx和BMP基因的表達的作用。分析各組細胞周期;繪制各組細胞生長曲線;檢測各組細胞Run

3、x2、BMP2表達的變化。用SPSS16.0軟件分析各組差異，P＜0.05為有顯著性。
　　結果:
　　(1)經檢測證明，ERα-shRNA-PLL3.7、ERβ-shRNA-PLL3.7、Smad4-shRNA-PLL3.7轉染細胞后相應目的基因表達明顯減弱，均有顯著性差異，P＜0.05。
　　(2)轉染后第3、5、7、9天時，4組細胞吸光度值(A490)由高到低依次為ERβRNAi組＞空白對照組＞ERαRNAi組＞

4、聯(lián)合沉默組，且各組間有顯著性差異，P＜0.05。4組細胞轉染后第3天經流式細胞儀檢測，結果顯示處于S期和G2期細胞百分率由高到低依次為:ERβRNAi組＞空白對照組＞ERαRNAi組＞聯(lián)合沉默組，且各組間有顯著性差異，P＜0.05。4組細胞轉染后第10天，用Realtime-PCR檢測Runx2、BMP2基因表達相對于空白對照組改變的倍數由高到低依次為ERβRNAi組＞空白對照組＞ERαRNAi組＞聯(lián)合沉默組，且各組間有顯著性差異，P＜

5、0.05。
　　(3)采用分層設計進一步檢測10個亞組細胞吸光度值(A490)并繪制生長曲線，結果顯示，轉染后第1天時，各組細胞比較均沒有顯著性差異，P＞0.05;但是于轉染后第3、5、7、9天時，10個亞組間的差異由高到低依次為ERβRNAi-ERα激動-Smad4正常紐＞ERβRNAi-ERα激動-Smad4RNAi組＞ERβRNAi-ERα正常-Smad4正常細＞ERβRNAi-ERα正常-Smad4RNAi組＞ERs正常-

6、Smad4正常組＞ERs正常-Smad4RNAi組＞ERαRNAi-ERβ激動-Smad4正常組＞ERαRNAi-ERβ正常-Smad4正常組＞ERαRNAi-ERβ激動-Smad4RNAi組＞ERαRNAi-ERβ正常-Smad4RNAi組，且除ERβRNAi-ERα激動-Smad4RNAi組與ERβRNAi-ERα激動-Smad4正常組比較，以及ERβRNAi-ERα正常-Smad4RNAi組與ERβRNAi-ERα正常-Smad4

7、正常組比較沒有顯著性差異，P＞0.05以外，其它各組間比較均有顯著性差異，P＜0.05。各組間Runx2基因表達相對于空白對照組改變的倍數由高到低的順序與細胞生長曲線基本相同。而BMP2基因表達由高到低的順序為ERβRNAi-ERα激動-Smad4正常組＞ERβRNAi-ERα激動-Smad4RNAi組＞ERβRNAi-ERα正常-Smad4正常組＞ERβRNAi-ERα正常-Smad4RNAi組＞ERs正常-Smad4正常組＞ERs正

8、常-Smad4RNAi組＞ERαRNAi-ERβ激動-Smad4正常組＞ERαRNAi-ERβ激動-Smad4RNAi組＞ERαRNAi-ERβ正常-Smad4正常組＞ ERαRNAi-ERβ正常-Smad4RNAi組，然而，無論ERαRNAi組還是ERβRNAi組中，Smad4RNAi亞組與Smad4正常亞組比較，BMP2基因表達均沒有顯著性差異，P＞0.05。
　　結論:
　　ERα和ERβ均具有調控椎體生長板軟骨細胞分