綠熒光蛋白轉基因小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞誘導分化成內(nèi)皮細胞的研究.pdf

1、血管組織工程(vesseltissueengineering)研究的重點問題之一是種子細胞，種子細胞來源缺乏是組織工程中的一大難題。內(nèi)皮細胞作為種子細胞在血管組織工程研究中具有重要作用，如何獲取足量的內(nèi)皮細胞是目前有待解決的問題。骨髓間充質(zhì)干細胞因具有取材方便、對機體無害、自體移植不存在免疫排斥問題以及分化類型廣泛等突出優(yōu)勢而有望成為血管組織工程中種子細胞的新來源。骨髓間充質(zhì)干細胞的分化機制和誘導條件目前尚未闡明。多數(shù)觀點認為，其與骨髓

2、間充質(zhì)干細胞所處的微環(huán)境密切相關，可能是微環(huán)境中所含的各種因子促成了骨髓間充質(zhì)干細胞向該環(huán)境所需要的細胞或組織分化。已有研究表明高表達的內(nèi)皮細胞生長因子和血流剪切力在骨髓間充質(zhì)干細胞向內(nèi)皮細胞的定向分化中均有顯著作用，但如何采用合理有效的誘導方式有待于進一步的探討。 目的:研究綠熒光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymalstemcells，MSCs)體外分離培養(yǎng)

3、及擴增能力，探討其骨髓間充質(zhì)干細胞在不同誘導條件和方式下向內(nèi)皮細胞定向分化能力，為在體研究提供實驗基礎。 方法:選用GFP小鼠作為研究對象，分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞，并在體外進行細胞的擴增和傳代;應用VEGFcDNA質(zhì)粒轉染和直接添加VEGF的方法對骨髓間充質(zhì)干細胞進行誘導，并比較兩者對GFP小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分化為內(nèi)皮細胞的作用，對其結果進行免疫熒光檢測，計算陽性細胞比例，統(tǒng)計分析。選出高效的誘導方式;分組誘導，實驗分為3個

4、實驗組，即①切應力組：直接置于平行板流動腔內(nèi)應用切應力(8dyn/cm2)誘導24h；②轉基因誘導靜止組：將MSCs細胞行VEGF質(zhì)粒轉染誘導培養(yǎng)；③轉基因誘導切應力組：將MSCs細胞行VEGF質(zhì)粒轉染誘導后置于平行板流動腔內(nèi)在切應力條件下(8dyn/cm2)誘導24h。之后再將各組細胞分別置于培養(yǎng)板培養(yǎng)1，3，5，7，10天，免疫熒光檢測其分化效果。 結果:MSCs每擴增一代，細胞數(shù)量增加4～8倍，7.0×103個原代MSCs

5、體外擴增3代即獲得1.4×108個細胞。連續(xù)傳代10代后仍可保持旺盛的分裂能力，說明GFP小鼠MSCs具有良好的體外的培養(yǎng)擴增的能力;直接添加濃度為25mg/1的VEGF誘導時，隨著時間推移，vWF陽性細胞比例逐步上升，其轉化率在添加誘導劑3d時達到高峰，而后逐步平穩(wěn)下降。用免疫熒光法檢測在添加誘導劑1、3、5、7、10d時MSCs分化為vWF陽性細胞比例分別為2.1％、23.3％、25.7％、23.5％、和21.8％。而經(jīng)VEGFcD

6、NA質(zhì)粒轉染骨髓間充質(zhì)干細胞時，隨著時間推移，vWF陽性細胞比例穩(wěn)步上升，用免疫熒光法檢測誘導1、3、5、7、10d時MSCs分化為vWF陽性細胞比例分別為1.3％、5.6％、14.4％、23.5％、和33.1％，其后期轉化率明顯高于直接添加VEGF的誘導組。以上結果說明，GFP小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞在VEGF的誘導下能有效地向內(nèi)皮細胞轉化，但隨著時間的推移，其轉化效果逐步降低。而通過VEGFcDNA質(zhì)粒轉染的方法使細胞自身表達VEGF，

7、可持續(xù)有效地促進骨髓間充質(zhì)干向內(nèi)皮細胞轉化;檢測誘導后培養(yǎng)1，3，5，7，10天的切應力組細胞，結果顯示在誘導3d時出現(xiàn)vWF表達陽性細胞，說明MSCs在流體切應力的作用下可以轉化成內(nèi)皮細胞。而轉質(zhì)粒誘導切應力組在轉質(zhì)粒誘導后，將MSCs移入平行板流動腔以8dyn/cm2的流切力誘導24h，(對照轉質(zhì)粒組繼續(xù)靜止培養(yǎng)24h)。培養(yǎng)1、3、5、7、10天后對其結果進行免疫熒光檢測，計算vWF陽性細胞比例。用免疫熒光法檢測分化為vWF陽性細

8、胞比例分別為2.1％、7.3％、20.8％、38.0％、和63.2％，與對照組差異顯著(P＜0.01)，說明在流體剪切力作用MSCs轉化率明顯高于對照組。結果表明，流體剪切力對骨髓間充質(zhì)干細胞向內(nèi)皮細胞轉化有明顯促進作用。 結論:GFP小鼠MSCs在VEGF作用下可以向ECs轉化，其轉化效果隨著VEGF因子的降解而降低；而VEGFcDNA質(zhì)粒轉染的方法可長期有效地促進骨髓間充質(zhì)干向內(nèi)皮細胞轉化;流體剪切力對骨髓間充質(zhì)干向內(nèi)皮細胞