TLR4基因轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞對(duì)支氣管哮喘的免疫調(diào)節(jié)作用.pdf

1、背景
　　 支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，屬于超敏反應(yīng)性質(zhì)，多種炎癥細(xì)胞、炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子與其發(fā)生發(fā)展有關(guān)，其中輔助T細(xì)胞亞群(Th1/Th2)的失衡、Th2細(xì)胞數(shù)量增加、功能活化起著關(guān)鍵作用。樹突狀細(xì)胞是目前已知的功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞(APC)，系已知唯一能活化初始T細(xì)胞的APC，是識(shí)別內(nèi)外源性抗原、調(diào)節(jié)天然免疫和獲得性免疫的關(guān)鍵因素。已知分布于氣道的DC是呼吸道免疫防御的前哨細(xì)胞，在通過胞飲、吞噬或受體介導(dǎo)的內(nèi)吞三

2、種方式攝取吸入性抗原后逐漸成熟，趨化因子、共刺激分子和MHCII類分子表達(dá)增加，而FcγRⅡ、FcγRⅠ和FcεRⅠ等表達(dá)減少，并于24小時(shí)內(nèi)從氣道遷移至縱隔淋巴結(jié)產(chǎn)生初級(jí)免疫應(yīng)答，促使初始Th細(xì)胞(Th0)向Th1或Th2分化。Tho的活化需DC參與的抗原識(shí)別信號(hào)和協(xié)同刺激信號(hào)，其分化方向受控于抗原刺激后DC分泌的細(xì)胞因子，IL-12和IFN-γ是誘導(dǎo)Th0向Th1分化的重要細(xì)胞因子。許多試驗(yàn)顯示DC的免疫調(diào)節(jié)作用與其細(xì)胞膜表面TLR

3、的表達(dá)有關(guān)，一般認(rèn)為相應(yīng)PAMP通過TLR4激活DC主要引起IL-12p70、IFNγ介導(dǎo)蛋白(IP-10)等細(xì)胞因子大量增加。鑒于樹突狀細(xì)胞TLR4對(duì)于T細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用，若將TLR4基因通過腺病毒載體導(dǎo)入抗原（如LPS）激發(fā)的DC，可促使DC分泌較多的IFN-γ等，上調(diào)Th0表達(dá)的IL-12Rβ2和TLR4，從而利于Th0向Th1分化。
　　 目的
　　 將轉(zhuǎn)染了TLR4基因和LPS致敏的DC輸入OVA誘導(dǎo)的過敏性

4、哮喘模型小鼠體內(nèi)，以促進(jìn)Th1的分化，逆轉(zhuǎn)過敏性哮喘的Th亞群失衡，從而通過TLR4基因轉(zhuǎn)移DC干預(yù)的免疫調(diào)節(jié)方式探討哮喘基因治療的新方法。
　　 方法
　　 1,利用RT-PCR方法，從Balb/c小鼠脾組織細(xì)胞mRNA中擴(kuò)增TLR4基因全長(zhǎng)cDNA，并將其連接到pcDNA3.1(+)載體上，進(jìn)行測(cè)序和核酸分析。
　　 2.采用AdMax包裝系統(tǒng)，將克隆了外源基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒與攜帶了腺病毒大部分基因組的包裝

5、質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，利用Cre/loxP系統(tǒng)的作用實(shí)現(xiàn)重組，產(chǎn)生重組腺病毒。RT-PCR方法檢測(cè)AdV-TLR4mRNA在傳代DC中的表達(dá)、Western Blot方法檢測(cè)AdV-TLR4蛋白的表達(dá)。
　　 3.RT-PCR方法檢測(cè)AdV-TLR4轉(zhuǎn)染的DCIL-12mRNA、IL-4mRNA和IFNγmRNA表達(dá)的變化；ELISA方法檢測(cè)AdV-TLR4轉(zhuǎn)染的DC培養(yǎng)上清IL-12、IL-4和IFN-γ的表達(dá)水平；流式細(xì)胞儀

6、分析AdV-TLR4轉(zhuǎn)染的DC表面免疫特性標(biāo)志蛋白Ia、CD40、CD80和CD86的改變。
　　 4.0.1％0VAAl(OH)3溶液皮下注射、1％OVA的生理鹽水溶液霧化吸入的方法制備小鼠哮喘模型；福爾馬林組織固定、包埋、切片，HE染色和AB/PAS復(fù)染進(jìn)行小鼠肺組織學(xué)形態(tài)觀察，Gimsa-Wright染色觀察BALF中Eos;骨髓細(xì)胞分離，紅細(xì)胞裂解液處理，GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)、RMPI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的方式獲

7、取DC，行哮喘小鼠DCTLR4mRNA和TLR4蛋白表達(dá)檢測(cè)；ELISA方法檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞IL-4、IL-5、IFN-γ和血漿IgE含量、人血漿IL-4和IgE含量、BALF中IL-4和IgE含量；流式細(xì)胞儀方法檢測(cè)脾細(xì)胞CD4+CD25+細(xì)胞百分比。
　　 結(jié)果
　　 1.擴(kuò)增得到的小鼠TLR4基因cDNA全長(zhǎng)2508bp，編碼536個(gè)氨基酸，blast結(jié)果分析表明，該cDNA與Genbank中發(fā)表的序列(NM0212

8、97)具有100％的同源性。
　　 2.重組質(zhì)粒pDC316-mTLR4的PCR及酶切鑒定表明，TLR4基因被定向插入；與pBHGF35骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞并包裝成病毒，經(jīng)病毒DNA的PCR檢測(cè)，證實(shí)已完成對(duì)重組病毒的包裝；重組病毒轉(zhuǎn)染小鼠DC，其TLR4mRNA和TLR4蛋白均明顯表達(dá)。
　　 3.誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分化的IL-12、IFN-γ在Ad-TLR4轉(zhuǎn)染DC后48小時(shí)表達(dá)量明顯增高，而誘導(dǎo)Th2細(xì)胞分化的IL

9、-4表達(dá)量明顯降低；轉(zhuǎn)染細(xì)胞的PCR檢測(cè)顯示IL-12mRNA、IL-4mRNA和IFN-γmRNA的變化與相應(yīng)蛋白表達(dá)量的變化具有一致性；LPS實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)顯示，LPS對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子的影響與LPS有關(guān)，LPS(+)轉(zhuǎn)染DC組上述細(xì)胞因子改變的幅度高于LPS（-）組，LPS具有促進(jìn)和加強(qiáng)Ad-TLR4-DC的某些生物學(xué)特性的改變。流式細(xì)胞檢測(cè)表明Ad5F35-mTLR4組DC細(xì)胞CD86表達(dá)較對(duì)照組和Ad5F35-mCMV-E

10、GFP明顯增高；進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)顯示，Ad5F35-mTLR4轉(zhuǎn)染DC LPS(+)組Ia、CD40和CD80表達(dá)較相應(yīng)LPS（-）明顯增高；LPS(+)對(duì)照組CD80和CD86表達(dá)也較相應(yīng)LPS（-）組明顯增高。LPS具有促進(jìn)和加強(qiáng)Ad-TLR4-DC細(xì)胞表面某些免疫特性標(biāo)志蛋白的改變。
　　 4.TLR4 DC懸液給予過敏性哮喘模型小鼠，顯示表現(xiàn)為杯狀細(xì)胞增生減少、氣道內(nèi)粘液減少，WBC數(shù)、Eso比率和IL-4水平均降低，而免疫

11、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CD4+CD25+細(xì)胞百分率增高，顯示TLR4 DC具有明顯的抗支氣管哮喘作用。TLR4 DC抗支氣管哮喘的機(jī)制，推測(cè)與TLR4 DC激發(fā)使具有調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化的細(xì)胞因子改變有關(guān)，如IFN-γ增加可促使Th1分化；TLR4DC進(jìn)入機(jī)體還促使了免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CD4+CD25+增加，免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)CD4+CD25+可增加機(jī)體對(duì)過敏物質(zhì)的耐受性，進(jìn)而可減輕其炎癥反應(yīng)。
　　 結(jié)論
　　 1.成功構(gòu)建了小鼠TLR4基

12、因的全長(zhǎng)編碼區(qū)cDNA。
　　 2.重組病毒感染滴度為2.3×108IU/ml，可用于體內(nèi)外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。在本研究中作為TLR4基因干預(yù)對(duì)機(jī)體Th1/Th2平衡影響的研究工具。
　　 3.LPS促進(jìn)Ad-TLR4-DC細(xì)胞表面Ia、CD40、CD80和CD86免疫特性標(biāo)志蛋白改變，促進(jìn)DCIL-12、IL-4和IFN-γ表達(dá)改變，推測(cè)這些改變與DCTLR4信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)。
　　 4.TLR4 DC對(duì)OVA誘導(dǎo)的支氣管炎