高糖對(duì)巨噬細(xì)胞TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的:糖尿病腎病（Diabetic Nephropathy，DN）是糖尿病(DiabetesMellitus，DM)造成的嚴(yán)重和危害性較大的一種慢性并發(fā)癥。其發(fā)病機(jī)制與慢性炎癥有關(guān)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和DN臨床患者的研究中均發(fā)現(xiàn)腎臟組織大量浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞以巨噬細(xì)胞為主。其浸潤(rùn)程度與腎組織的損害程度趨勢(shì)一致呈正相關(guān)。因此，巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是加快DN發(fā)展的重要原因之一。TLR4是巨噬細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體， TLR4信號(hào)通路在DN的發(fā)病中的作用

2、逐漸受到人們的關(guān)注，許多臨床和實(shí)驗(yàn)均表明TLR4在高糖狀態(tài)下表達(dá)增高。生理?xiàng)l件下LPS結(jié)合巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞表面的TLR4可誘導(dǎo)促炎信號(hào)和抗炎信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，分別產(chǎn)生促炎因子TNF-α、IL-β和抗炎因子IL-10，來(lái)維持炎癥因子的平衡。那么，在糖尿病狀態(tài)下巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的TLR4的激活是否改變了這種平衡狀態(tài)，導(dǎo)致DN的發(fā)生呢？目前還未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道。因此，本課題依據(jù)前期結(jié)果和文獻(xiàn)資料，在體外用高糖培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，用TLR4的不同配體進(jìn)行刺激，觀

3、察TLR4介導(dǎo)的促炎和抗炎信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的表達(dá)，探討高糖對(duì)巨噬細(xì)胞TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，明確巨噬細(xì)胞在DM和DN發(fā)生中的炎癥機(jī)制。
　　方法:
　　1、經(jīng)PMA活化的THP-1細(xì)胞同時(shí)用正常培養(yǎng)基和高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后，再用LPS刺激，在0、2、4、8、16、24小時(shí)收集細(xì)胞。用Real-timePCR檢測(cè)炎癥因子IL-10、IL-1β、TNF-α mRNA的表達(dá)水平。
　　2、經(jīng)PMA活化的THP-1細(xì)胞同時(shí)用正

4、常培養(yǎng)基和高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后，再用LPS刺激，在0、2、4、8、16、24小時(shí)收集細(xì)胞上清;用HSP60刺激24h收集細(xì)胞上清用ELISA檢測(cè)炎癥因子IL-10、IL-1β、TNF-α的表達(dá)水平。
　　3、經(jīng)PMA活化的THP-1細(xì)胞同時(shí)用正常培養(yǎng)基和高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后，再用LPS刺激，在0、15、30、60、120、180min收集細(xì)胞。另一組用LPS和HSP60刺激，在0、30、60、180min收集細(xì)胞，用Wes

5、ternblot檢測(cè)p110δ、P-NF-κB p65、NF-κB p65、P-AKT、AKT的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1、與空白對(duì)照組相比，IL-10mRNA正常組與高糖組在2h、4h時(shí)表達(dá)明顯增高，IL-1β mRNA正常組與高糖組在2h、4h、8h時(shí)表達(dá)明顯增高，TNF-αmRNA的正常組與高糖組在2h、4h、16h、24h時(shí)表達(dá)明顯增高。對(duì)照組IL-10mRNA表達(dá)量的高峰值出現(xiàn)在LPS刺激后的2小時(shí)，高糖組出現(xiàn)

6、在4小時(shí)，出現(xiàn)延遲現(xiàn)象。高糖組在4小時(shí)IL-1βmRNA表達(dá)量明顯高于正常組。高糖組在2小時(shí)TNF-α mRNA表達(dá)量顯著高于正常組。
　　2、上清ELISA結(jié)果，IL-10無(wú)明顯變化，LPS刺激時(shí)，IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生隨著時(shí)間延長(zhǎng)均逐漸升高，且高糖組在任一時(shí)間點(diǎn)均高于正常組。LPS和HSP60同時(shí)刺激24h時(shí)，LPS刺激下IL-1β、TNF-α變化顯著，且高糖組高于正常組，HSP60刺激下變化不明顯。
　　3、We

7、stern blot結(jié)果顯示:LPS刺激細(xì)胞0、15、30、60、120、180min，P-NF-κB p6515分鐘時(shí)表達(dá)量增加，正常組60分鐘，高糖組15分鐘時(shí)時(shí)達(dá)到高峰，P-AKT60分鐘時(shí)表達(dá)增高，高糖組在同一時(shí)間點(diǎn)總體高于正常組;LPS和HSP60刺激細(xì)胞0、30、60、180min，高糖狀態(tài)下p110δ無(wú)論在LPS還是HSP60刺激下表達(dá)水平降低，P-NF-κB p65、P-AKT在LPS的作用下變化明顯。
　　結(jié)論: