鋅指蛋白zbtb20對巨噬細胞TLR4信號轉(zhuǎn)導的調(diào)控作用.pdf

1、本課題研究了鋅指蛋白zbtb20對巨噬細胞TLR4信號轉(zhuǎn)導的調(diào)控作用。主要構建了zbtb20真核表達載體并建立了小鼠腹腔巨噬細胞的zbtb20干擾模型和小鼠巨噬細胞系RAW264.7的zbtb20穩(wěn)定表達模型，發(fā)現(xiàn)干擾zbtb20的表達可以抑制LPS誘導的巨噬細胞分泌炎癥細胞因子和Ⅰ型干擾素，并抑制ERK,JNK,P38的活化；以zbtb20基因缺陷小鼠的巨噬細胞為模型進一步驗證了該結果。相反，過表達zbtb20具有促進效應。因此，zb

2、tb20是TLR4信號通路的正向調(diào)控分子。
　　 鋅指蛋白zbtb20對巨噬細胞TLR4信號轉(zhuǎn)導的調(diào)控作用
　　 Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是一類重要的模式識別受體(PRRs)，因其與果蠅中的Toll基因相似而得名[1,2,3,4]，其通過識別病原體相關分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)而啟動免疫應答和炎癥反應[5]

3、。目前至少已經(jīng)報道了11種人TLRs和13種小鼠TLRs[6,7]。TLR4是最早發(fā)現(xiàn)的人TLR[8],LPS與其結合可以啟動MyD88(Myeloid different factory88)依賴的和TRIF(TIR domaincontaining adaptor inducing interferon-β)依賴的信號通路，介導炎性細胞因子和干擾素的產(chǎn)生，以清除外來病原體。但TLRs的過度活化會導致自身免疫病、內(nèi)毒素休克等免疫病理狀

4、態(tài)，所以TLRs信號轉(zhuǎn)導中存在著精細的調(diào)控機制以保持機體的穩(wěn)態(tài)。
　　 鋅指蛋白zbtb20(zinc finger and BTB domain containing20)是由本研究團隊最早從人樹突狀細胞cDNA文庫中克隆出的一個新的全長cDNA并于2001年率先報道[9]，因其是樹突細胞來源的BTB/POZ鋅指蛋白，所以當時稱之為DPZF(BTB/POZzincfinger protein deriving from hum

5、an dendritic cells)。早期研究發(fā)現(xiàn)其在造血系統(tǒng)特別是免疫細胞中能夠比較優(yōu)勢表達。近年來對其所作的研究主要集中于神經(jīng)系統(tǒng)和肝臟[10,11,12,13]，對于其在免疫系統(tǒng)中的功能和作用機制至今還沒有報道。本課題對zbtb20在TLR4信號轉(zhuǎn)導中的作用及其相關機制進行了初步的探討。
　　 一、小鼠zbtb20的克隆和表達
　　 我們使用小鼠巨噬細胞RAW264.7的cDNA克隆了zbtb20的全長核苷酸序列

6、，并以此序列為模板構建了zbtb20真核表達載體。同時我們用LPS(100ng/ml)刺激小鼠腹腔巨噬細胞觀察在不同的時間點zbtb20表達量的變化。定量PCR的結果顯示，隨著時間的延長，zbtb20的表達量下降，這種誘導性的表達變化提示我們zbtb20有可能在TLR4的信號轉(zhuǎn)導中發(fā)揮作用。
　　 二、過表達zbtb20對巨噬細胞TLR4信號轉(zhuǎn)導的調(diào)控
　　 我們將構建的zbtb20真核表達載體轉(zhuǎn)入巨噬細胞系RAW264

7、.7，采用新霉素篩選的方法，得到了zbtb20的穩(wěn)定表達細胞株，稱之為RAW-zbtb20。采用RT-PCR和Westonblotting的方法證實了RAW-zbtb20細胞的過表達zbtb20效果。同時我們利用此細胞株為模型觀察了zbtb20對LPS觸發(fā)的TLR4信號通路的調(diào)控作用。首先我們用LPS(100ng/ml)刺激RAW-zbtb20，觀察前炎性細胞因子和IFN-β的變化，RT-PCR和ELISA實驗證實了zbtb20過表達可

8、以顯著提高細胞因子的分泌。同時我們也觀察了過表達zbtb20對LPS誘導的巨噬細胞絲裂原活化的蛋白激酶通路(包括ERK、JNK、P38)的影響，結果顯示，過表達zbtb20可以明顯提高LPS觸發(fā)的ERK、JNK、P38的活化。
　　 三、干擾zbtb20表達和zbtb20缺陷對巨噬細胞TLR4信號轉(zhuǎn)導的調(diào)控
　　 我們用RNA干擾技術設計了zbtb20的siRAN，并將siRAN轉(zhuǎn)入小鼠腹腔巨噬細胞，定量PCR證明其干擾

9、效率可以達到80％；用LPS刺激此細胞，用定量PCR和ELISA檢測了細胞因子的變化，結果與過表達zbtb20相反，即干擾zbtb20可以抑制LPS觸發(fā)的巨噬細胞分泌前炎性細胞因子和IFN-β。以zbtb20基因缺陷小鼠的巨噬細胞為模型進一步驗證了該結果。
　　 綜上所述，我們的研究結果表明，鋅指蛋白zbtb20參與了巨噬細胞TLR4的信號轉(zhuǎn)導通路并發(fā)揮正向調(diào)控的作用，其能夠促進TLR4觸發(fā)的前炎性細胞因子和IFeN-β的產(chǎn)生。