TLR4‐Src調(diào)控巨噬細(xì)胞脂質(zhì)累積的研究.pdf

1、【目的】
　　動(dòng)脈粥樣硬化是導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的主要病理基礎(chǔ)，氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，oxLDL）在巨噬細(xì)胞內(nèi)的沉積，通過引起并增強(qiáng)局部慢性炎癥，加速動(dòng)脈粥樣硬化過程，而局部慢性炎癥是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)。我們及其他實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)論證 toll樣受體4（Toll like receptor4，TLR4）在巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)累積及炎癥反應(yīng)過程中起重要作用。TLR4

2、首度被發(fā)現(xiàn)是通過識(shí)別脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）和活化包含 Src激酶的下游信號(hào)，在固有免疫發(fā)揮了重要的作用。作為一種非受體酪氨酸激酶，Src被認(rèn)為和多種信號(hào)通路和細(xì)胞過程有關(guān)。作為多種內(nèi)源性、外源性刺激的“整合因子”，調(diào)控巨噬細(xì)胞的生長(zhǎng)，遷移，黏附，及脂質(zhì)代謝過程。本研究中，通過利用oxLDL刺激巨噬細(xì)胞體外模擬動(dòng)脈粥樣硬化過程，探討TLR4-Src信號(hào)傳導(dǎo)通路在oxLDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞吞脂及炎癥過程中所發(fā)

3、揮的調(diào)控作用。
　　【方法】
　?。?）收集人粥樣硬化病變的股動(dòng)脈以及作為正常對(duì)照的乳內(nèi)動(dòng)脈標(biāo)本，提取組織蛋白，用western-blot檢測(cè)組織樣品中Src激活情況。
　?。?）體外培養(yǎng)人原代巨噬細(xì)胞及Raw264.7巨噬細(xì)胞系，給予oxLDL刺激誘導(dǎo)，，研究人動(dòng)脈粥樣硬化斑塊組織中Src激活的增加與oxLDL的關(guān)系。
　　（3）分別使用Src特異性siRNA轉(zhuǎn)染，及PP2(10μM)或 PP3(10μM)預(yù)處

4、理Raw264.7細(xì)胞30分鐘后（PP3作為PP2的陰性對(duì)照），再加入oxLDL（50ug/mL）刺激細(xì)胞24小時(shí)。通過分別抑制Src蛋白表達(dá)或者激活以觀察Src對(duì)于巨噬細(xì)胞脂質(zhì)累積的影響。
　?。?）導(dǎo)入Src siRNA或TLR4 siRNA以敲減巨噬細(xì)胞TLR4或者Src蛋白表達(dá)水平，用oxLDL（50ug/ml）刺激細(xì)胞24h，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)CD36及LOX-1的蛋白表達(dá)，檢測(cè)TLR4/Src經(jīng)由哪種受體調(diào)控細(xì)胞脂質(zhì)累積。

5、r>　　（5）以上述方抑制Src表達(dá)水平和活性之后，使用oxLDL刺激細(xì)胞24h，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中炎癥因子IL6、IL8、MCP-1和MMP-2的含量。
　?。?）收集人粥樣硬化病變的股動(dòng)脈以及作為正常對(duì)照的乳內(nèi)動(dòng)脈標(biāo)本，HE染色及免疫組化分析，檢測(cè)動(dòng)脈粥樣斑塊組織中 CD68、TLR4、Src表達(dá)水平；對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊組織進(jìn)行免疫熒光染色，檢測(cè)動(dòng)脈粥樣斑塊組織中CD68、TLR4、Src的表達(dá)定位。
　?。?）TLR

6、4特異性siRNA導(dǎo)入RAW264.7細(xì)胞中，并以導(dǎo)入陰性對(duì)照（NC）為參照，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后 oxLDL（50ug/ml）刺激1小時(shí)，檢測(cè)Src激活情況。
　?。?）oxLDL（50ug/ml）刺激Raw264.7細(xì)胞0，15，30，60分鐘，采用免疫共沉淀法，檢測(cè)TLR4與Src在體外的結(jié)合情況。
　?。?）將TLR4特異性siRNA導(dǎo)入Raw264.7細(xì)胞系后，oxLDL（50ug/ml）刺激細(xì)胞60分鐘后，通過細(xì)胞免疫

7、熒光法，檢測(cè)細(xì)胞Src、TLR4的表達(dá)水平，并進(jìn)行共定位。
　?。?0）導(dǎo)入TRAF6 siRNA以降低TRAF6的表達(dá)水平48h，oxLDL（50ug/ml）刺激60分鐘，進(jìn)一步通過免疫共沉淀法，檢測(cè)TLR4和Src的結(jié)合水平。（11）oxLDL（50ug/ml）刺激巨噬細(xì)胞60分鐘，采用免疫共沉淀法檢測(cè)TLR4與Fyn及Lyn的結(jié)合情況。
　　【結(jié)果】
　　（1）與人動(dòng)脈正常組織相比較，粥樣硬化病變組織中Src激活

8、顯著性增加。
　?。?）oxLDL刺激巨噬細(xì)胞后，Src的表達(dá)活性增加，并呈時(shí)間和劑量依賴性。
　?。?）抑制了Src表達(dá)和激活后，oxLDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的吞脂反應(yīng)顯著下降。
　?。?）抑制細(xì)胞內(nèi)Src及TLR4表達(dá)水平后，oxLDL誘導(dǎo)的CD36表達(dá)水平下降。
　　（5）抑制細(xì)胞內(nèi)Src表達(dá)水平及活性后，炎癥因子IL6、IL8、MCP-1和MMP-2的分泌量下降。
　?。?）相較于正常乳內(nèi)動(dòng)脈組織，發(fā)

9、生動(dòng)脈粥樣硬化病變的股動(dòng)脈組織中，巨噬細(xì)胞（CD68陽(yáng)性細(xì)胞）高富集于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊脂核區(qū)，且巨噬細(xì)胞中TLR4表達(dá)量及Src激酶酪氨酸418位點(diǎn)活化均升高，免疫熒光結(jié)果示Src與TLR4共定位于CD68陽(yáng)性細(xì)胞中。
　?。?）與oxLDL（-）組相比，oxLDL刺激巨噬細(xì)胞后，其Src激酶磷酸化顯著升高，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（**P<0.01）。當(dāng)TLR4表達(dá)下調(diào)時(shí)（TLR4特異性siRNA組），oxLDL誘導(dǎo)Src激酶磷酸化能

10、力顯著性受到抑制，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（## P<0.01）。
　?。?）oxLDL刺激Raw264.7細(xì)胞30和60分鐘組，TLR4和Src能夠相互作用并結(jié)合在一起。
　?。?）oxLDL刺激后，細(xì)胞膜表面可見紅色TLR4及綠色Src免疫染色，證實(shí)細(xì)胞膜表面有TLR4及Src表達(dá)。融合照片可見，TLR4和Src共定位于RAW264.7細(xì)胞膜表面，黃色區(qū)域?yàn)槿诤蠀^(qū)域。且TLR4特異性siRNA處理組，可見其Src表達(dá)水平明顯下

11、降。
　?。?0）TRAF6敲減后，TLR4與Src結(jié)合無(wú)明顯變化。
　　（11）oxLDL（50ug/ml）刺激巨噬細(xì)胞60分鐘后，Src家族成員Fyn及Lyn未見與TLR4結(jié)合
　　【結(jié)論】
　　oxLDL通過TLR4介導(dǎo)，誘導(dǎo)Src表達(dá)激活升高，并促進(jìn)TLR4/Src復(fù)合體形成，調(diào)控巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積及炎癥反應(yīng)過程，從而參與到動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程中。而此過程與巨噬細(xì)胞膜表面清道夫受體CD36表達(dá)水平有關(guān)，但不