葡萄糖神經(jīng)酰胺合成酶在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)研究.pdf

1、背景與目的：
　　 乳腺癌是我國(guó)發(fā)病率很高的惡性腫瘤，嚴(yán)重的威脅著廣大女性的健康?；熓悄壳爸委熑橄侔┑闹匾闹委熓侄危捎谌橄侔┌殡S在化療過(guò)程中所產(chǎn)生的多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)現(xiàn)象，常常導(dǎo)致化療的失敗，嚴(yán)重影響乳腺癌患者的生存期和生存質(zhì)量，是目前乳腺癌化療的主要障礙，也是正在困擾腫瘤臨床治療的關(guān)鍵性難題。以往對(duì)乳腺癌耐藥機(jī)理的研究多集中在多藥耐藥相關(guān)的基因及P-gP等方面，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)神經(jīng)酰胺

2、糖基化水平的提高可能是腫瘤細(xì)胞形成MDR的一個(gè)新的機(jī)制。葡萄糖神經(jīng)酰胺合成酶(glucosylceramide synthase)可以催化神經(jīng)酰胺糖基化生成了葡萄糖神經(jīng)酰胺，失去了其神經(jīng)酰胺的細(xì)胞凋亡作用，腫瘤細(xì)胞凋亡減少，從而引起腫瘤細(xì)胞的MDR。
　　 本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞活性(Cell Counting kit-8，CCK-8)法檢測(cè)阿霉素(adriamycin，ADR)，順鉑(DDP)，5-氟尿嘧啶(5-FU)對(duì)人乳腺癌敏感細(xì)

3、胞株MCF-7和20μmol/L的GCS抑制劑(PDMP)預(yù)處理MCF-7/ADR24h前后的耐藥細(xì)胞株MCF-7/ADR的半數(shù)抑制濃度(IC50)，然后用RT-PCR和Western blot法檢測(cè)MCF-7及PDMP處理前后的MCF-7/ADR細(xì)胞中GCS、P-gp、Bc1-2的mRNA和蛋白表達(dá)，從mRNA和蛋白水平研究GCS、P-gp、Bc1-2與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展以及多藥耐藥產(chǎn)生的關(guān)系，為臨床乳腺癌耐藥的治療提供一定的理論方向，

4、從而節(jié)約乳腺癌患者的治療成本并為醫(yī)療事業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展打下基礎(chǔ)并提供可靠依據(jù)。
　　 方法：
　　 1．常規(guī)培養(yǎng)MCF-7/ADR和MCF-7兩種細(xì)胞，其中MCF-7/ADR細(xì)胞培養(yǎng)液中加入阿霉素(adriamycin，ADR)200ug/L，以維持其相應(yīng)的耐藥表型。于檢測(cè)前撤除ADR培養(yǎng)2周。
　　 2．采用細(xì)胞活性(Cell Counting kit-8，CCK-8)法檢測(cè)阿霉素(adriamycin，ADR)

5、，順鉑(DDP)，氟尿嘧啶(5-FU)對(duì)人乳腺癌敏感株MCF-7和20μmol/L的GCS抑制劑(PDMP)預(yù)處理MCF-7/ADR24h前后的耐藥細(xì)胞株MCF-7/ADR的敏感性(IC50)。
　　 3.RT-PCR和westernblot法在mRNA水平和蛋白水平上檢測(cè)MCF-7及PDMP預(yù)處理MCF-7/ADR前后GCS、P-gp、Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1．CCK8結(jié)果：MC

6、F-7/ADR細(xì)胞對(duì)ADR、DDP、5-FU的IC50均高于MCF-7(p＜0.05)。表明MCF-7/ADR對(duì)ADR、DDP、5-FU等多種化療藥物有耐藥性。PDMP作用后ADR、DDP、5-FU對(duì)MCF-7/ADR的IC50下降(p＜0.05)。
　　 2．RT-PCR和Western blot結(jié)果：GCS在MCF-7、MCF-7/ADR、PDMP作用后的MCF-7/ADR細(xì)胞中均有表達(dá)，GCSmRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量在耐

7、藥細(xì)胞MCF-7/ADR表達(dá)水平較高，顯著高于親本細(xì)胞MCF-7(p＜0.05)，PDMP作用后的MCF-7/ADR細(xì)胞GCSmRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量降低。P-gp和Bc1-2也具有與GCS類(lèi)似的結(jié)果。
　　 結(jié)論：
　　 1．乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MCF-7/ADR中均有GCS、P-gp、Bc1-2的表達(dá)，但不同的細(xì)胞表達(dá)水平不同。耐藥細(xì)胞株MCF-7/ADR中GCSmRNA和蛋白的表達(dá)水平較高，明顯高于其親本細(xì)胞株