LMP2A對鼻咽癌ERK1-2信號、EMT和轉(zhuǎn)移的影響及機制.pdf

1、[目的]：
　　探討LMP2A是否通過激活ERK1/2信號通路誘導(dǎo)EMT促進鼻咽癌細(xì)胞遷移，并分析其與鼻咽癌臨床惡性進展的關(guān)系。
　　[方法]：
　　1.應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法檢測128例石蠟標(biāo)本（鼻咽黏膜慢性炎26例、鼻咽癌74例和鼻咽癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例）中LMP2A、ERK1/2、 p-ERK1/2、 N-cadherin、Snail和MMP-9蛋白的表達(dá)情況，并分析上述蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性及與臨床病理學(xué)參數(shù)之間

2、的關(guān)系。
　　2.用劃痕實驗、Transwell實驗觀察LMP2A對鼻咽癌細(xì)胞CNE2遷移能力的影響。
　　3.應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色和Western blot法檢測LMP2A、ERK1/2、p-ERK1/2、N-cadherin、Snail和MMP-9蛋白在CNE2-LMP2A、CNE2-Vector和CNE2細(xì)胞中的表達(dá)情況;熒光定量PCR檢測LMP2A、N-cadherin、Snail和MMP-9 mRNA在上述細(xì)胞中的

3、表達(dá)水平;免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測LMP2A和p-ERK1/2在上述細(xì)胞中表達(dá)水平和p-ERK1/2細(xì)胞內(nèi)定位情況。
　　4.不同濃度ERK1/2抑制劑PD98059作用于CNE2-LMP2A細(xì)胞48h后，觀察其對細(xì)胞遷移能力和N-cadherin、Snail及MMP-9表達(dá)影響。
　　[結(jié)果]：
　　1.LMP2A、ERK1/2信號和EMT標(biāo)志物蛋白表達(dá)與鼻咽癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系
　　(1) LMP2A、ERK1/2信號和

4、EMT標(biāo)志物在鼻咽癌及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的表達(dá)
　　LMP2A蛋白在鼻咽癌組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中陽性表達(dá)率分別為64.9％(48/74)和78.6％(22/28)，顯著高于鼻咽黏膜慢性炎的26.9％(7/26)（P均＜0.01）;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的陽性表達(dá)率高于原發(fā)性鼻咽癌，差異性無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　ERK1/2、p-ERK1/2和MMP-9蛋白在鼻咽癌組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中陽性表達(dá)率分別為71.6％(53/74)、51.4

5、％(38/74)、62.2％(46/74)和78.6％(22/28)、75.0％(21/28)、78.6％(22/28)，均顯著高于鼻咽黏膜慢性炎的19.2％(5/26)、11.5％(3/26)和19.2％(5/26)(P＜0.01或P＜0.05);p-ERK1/2蛋白在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中陽性表達(dá)率顯著高于原發(fā)性鼻咽癌(P＜0.05)。
　　N-cadherin和Snail蛋白在鼻咽癌組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中陽性表達(dá)率相同，分別為52.7％(

6、39/74)和75.0％(21/28)，顯著高于鼻咽黏膜慢性炎的15.4％(4/26)和11.5％(3/26)（P均＜0.01）;N-cadherin、Snail蛋白在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中陽性表達(dá)率顯著高于原發(fā)性鼻咽癌（P均＜0.05）。
　　(2) LMP2A、ERK1/2信號和EMT標(biāo)志物蛋白表達(dá)之間的關(guān)系
　　LMP2A與ERK1/2、p-ERK1/2、N-cadherin、Snail、MMP-9蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（P均＜0.0

7、1）;p-ERK1/2與N-cadherin、Snail、MMP-9蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(P均＜0.01);Snail與N-cadherin、MMP-9蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（P均＜0.01）。
　　(3) LMP2A、ERK1/2信號和EMT標(biāo)志物蛋白與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系
　　LMP2A、p-ERK1/2、N-cadherin、Snail和MMP-9蛋白陽性表達(dá)率在N分期(N0～N1 vs.N2～N3)和臨床分期(Ⅰ～Ⅱ vs.Ⅲ

8、～Ⅳ)中的差異性有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。LMP2A和p-ERK1/2蛋白陽性表達(dá)率在T分期(T1～T2 vs.T3～T4)中的差異性有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。上述5種蛋白陽性表達(dá)率在年齡(＜50歲vs.≥50歲)、性別（男vs.女）和M分期（無vs.有）中的差異性無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。
　　2.劃痕和Transwell實驗觀察LMP2A對鼻咽癌細(xì)胞CNE2遷移能力的影響
　　(1)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察:轉(zhuǎn)染

9、外源性LMP2A的CNE2細(xì)胞株(CNE2-LMP2A)中出現(xiàn)較多纖維母細(xì)胞樣梭形細(xì)胞（即EMT樣細(xì)胞形態(tài)），其梭形細(xì)胞數(shù)（36±4個）顯著多于CNE2-Vector（2±1個）和CNE2（0個）（P均＜0.01）。
　　(2)劃痕實驗:細(xì)胞培養(yǎng)48h，CNE2-LMP2A細(xì)胞相對遷移距離（5.81±0.04）顯著大于CNE2-Vector（1.51±0.02）和CNE2（1.47±0.03）（P均＜0.01）。
　　(3)

10、 Transwell實驗:CNE2-LMP2A穿過Transwell小室膜細(xì)胞數(shù)（283±21個）顯著多于CNE2-Vector（104±18個）和CNE2（113±21個）（P均＜0.01）。
　　3.LMP2A對NPC細(xì)胞ERK1/2信號和EMT的影響及機制
　　(1)免疫細(xì)胞化學(xué)染色:LMP2A與ERK1/2、p-ERK1/2、N-cadherin、Snail、MMP-9蛋白在CNE2-LMP2A細(xì)胞中染色強度均高于C

11、NE2-Vector和CNE2。
　　(2)免疫熒光細(xì)胞化學(xué):p-ERK1/2熒光定位于胞核，CNE2-LMP2A中p-ERK1/2核陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)（11±3個）顯著高于CNE2-Vector（2±1個）和CNE2（2±1個）（P均＜0.05），提示LMP2A可促進p-ERK1/2轉(zhuǎn)位（即ERK1/2信號活化）。
　　(3) RT-PCR: LMP2A、N-Cadherin、Snail和MMP-9 mRNA在CNE2-LMP

12、2A細(xì)胞中表達(dá)水平顯著高于CNE2-Vector和CNE2(P均＜0.05)。
　　(4) Western blot:LMP2A、p-ERK1/2、N-cadherin、Snail和MMP-9蛋白在CNE2-LMP2A細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著高于CNE2-Vector和CNE2(P均＜0.05);ERK1/2蛋白在三種細(xì)胞中表達(dá)水平的差異性無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。
　　4.抑制ERK1/2信號對NPC細(xì)胞遷移能力和EMT

13、的影響
　　(1) Western blot:0、10、25、50和100μmol/L PD98059作用于CNE2-LMP2A細(xì)胞48h，其p-ERK1/2蛋白水平隨PD98059濃度增加而逐漸下降，而ERK1/2蛋白水平則無明顯變化，表明PD98059可抑制p-ERK1/2蛋白表達(dá)。
　　(2)劃痕實驗:0、50和100μmol/L PD98059作用于CNE2-LMP2A細(xì)胞48h，其相對遷移距離分別為（5.99±0.

14、03）、（2.21±0.01）和（1.46±0.01），三組細(xì)胞兩兩比較，差異性有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.01）。
　　(3) Transwell實驗:0、50和100μmol/L PD98059作用于CNE2-LMP2A細(xì)胞48h，其穿過小室膜細(xì)胞數(shù)分別為（307±22個）、（164±11個）和（67±11個），三組細(xì)胞兩兩比較，差異性有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.01）。
　　(4) RT-PCR:0、10、25、50和100μ

15、mol/L PD98059作用于CNE2-LMP2A細(xì)胞48h，MMP-9 mRNA表達(dá)水平隨PD98059濃度增加而逐漸下降，其中100μmol/L者與其余各組比較，差異性有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.01）;而N-cadherin和Snai1mRNA表達(dá)水平隨PD98059濃度增加卻無明顯變化。
　　[結(jié)論]：
　　LMP2A高表達(dá)與鼻咽癌臨床惡性進展（尤其是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）相關(guān)，其促進鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移的可能機制:(1) LMP2A