豬呼吸道上皮細(xì)胞抗病毒miRNAs鑒定.pdf

1、豬呼吸系統(tǒng)疾病(Swine respiratory diseases，SRD)嚴(yán)重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，它的致病機(jī)理復(fù)雜，可以由一種或多種病毒、細(xì)菌、寄生蟲引起，也可隨著環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)、應(yīng)激和豬只自身健康程度的變化而改善或加重。病毒是SRD的主要病原菌之一，天然免疫系統(tǒng)通過模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptor，PRR)與病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associatedmolecular patte

2、rn，PAMP)相互作用，識(shí)別病毒并啟動(dòng)相應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，啟動(dòng)合成干擾素、白細(xì)胞介素等細(xì)胞因子及一系列下游抗病毒相關(guān)分子，抑制病毒在體內(nèi)的增殖。上皮細(xì)胞不僅是病原微生物入侵呼吸道的物理屏障，還能啟動(dòng)天然免疫反應(yīng)抵御病毒入侵，是防御呼吸道疾病的第一道屏障。miRNAs是生物體內(nèi)的一類長(zhǎng)度約21～25nt的非編碼小RNA，通過在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)而參與各項(xiàng)生命活動(dòng)，已有研究表明miRNAs與機(jī)體的疾病抗性/易感性密切相關(guān)。解析呼吸道上皮

3、細(xì)胞抗病毒天然免疫反應(yīng)的分子機(jī)制，鑒定抗病毒相關(guān)miRNAs及其作用，是防治呼吸道疾病的關(guān)鍵。大多數(shù)病毒的PAMP是雙鏈RNA(Double-stranded RNA，dsRNA)，人工合成的dsRNA-Poly(I∶ C)能夠有效地激活機(jī)體的抗病毒天然免疫反應(yīng)。因此，本研究利用Poly(I∶ C)刺激原代培養(yǎng)的豬呼吸道上皮細(xì)胞，通過高通量測(cè)序技術(shù)分析對(duì)照組和刺激組miRNAs的表達(dá)和編輯情況、鑒定新miRNAs，在此基礎(chǔ)上，選擇感興趣

4、的miRNAs進(jìn)行靶基因鑒定和誘導(dǎo)表達(dá)、組織表達(dá)分析，并分析了miR-20a對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、自噬及炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴利用組織塊原代培養(yǎng)法和差速貼壁純化法，成功獲得了豬呼吸道上皮細(xì)胞，經(jīng)角蛋白CK18單克隆抗體鑒定，確定為上皮類型的細(xì)胞，且純度較高。⑵經(jīng)HiSeq高通量測(cè)序，對(duì)照組和處理組各得到13，339，772和11，987，962條純凈序列，序列長(zhǎng)度集中在18～26 nt之間，峰值位于22

5、nt;獲得差異表達(dá)顯著的miRNAs23個(gè)(p＜0.01，|log2ratio|＞1)，其中19個(gè)在Poly(I∶ C)刺激下下調(diào)表達(dá)，4個(gè)上調(diào)表達(dá)。利用MIRANDA、TARGETSCAN和PICTAR三個(gè)軟件，共同預(yù)測(cè)到386個(gè)基因是差異表達(dá)的miRNAs潛在靶序列，這些靶基因主要富集在細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的正負(fù)調(diào)控、胚胎發(fā)育、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等生物過程方面(p＜0.05)。⑶隨機(jī)選取兩個(gè)差異表達(dá)miRNAs(miR-10

6、1和miR-20a)，利用雙熒光素酶報(bào)告基因分析和定點(diǎn)突變方法對(duì)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的潛在靶基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-101能有效地抑制所選取的所有潛在靶基因（SOX9，TLK2，RANBP9，BCL9，EZH2，SOCS5，CDH11和DR1）的表達(dá)，在選取的8個(gè)潛在靶基因中，miR-20a能對(duì)其中的5個(gè)（HLF，ITGB8，ARID4B，SLC40A1和MAP3K2）進(jìn)行調(diào)控，對(duì)ENNP5，F(xiàn)BXL5和GPR6基因的表達(dá)無(wú)影響。⑷

7、測(cè)序表明miRNAs中存在大量的堿基編輯現(xiàn)象，處理組和對(duì)照組分別有78和87個(gè)miRNAs發(fā)生編輯，占所檢測(cè)到miRNAs總數(shù)的57.35％和62.14％，堿基編輯包含所有的堿基替代類型，其中以A＞G堿基編輯形式最多，在對(duì)照組和處理組中分別占27.89％和29.38％，其次為G＞A(12.2％和12.59％)和G＞T(11.39％和11.9％)。Poly(I∶ C)處理對(duì)堿基編輯產(chǎn)生一定的影響:對(duì)照組和處理組中各存在14種和5種特有的堿

8、基編輯現(xiàn)象;miRNAs成熟序列5'端第5個(gè)堿基的編輯也在對(duì)照組和處理組中表現(xiàn)出差異。雙熒光素酶報(bào)告基因和定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)表明，第5個(gè)堿基編輯對(duì)miRNAs識(shí)別和結(jié)合靶基因具有重要影響，當(dāng)突變掉第5個(gè)堿基(G/T)后，miR-101失去了對(duì)靶基因的識(shí)別、結(jié)合能力。⑸在處理組和對(duì)照組中分別檢測(cè)到83條和82條新的miRNAs，其中47個(gè)在兩組中共同存在。物種間保守性分析顯示，共有19個(gè)新miRNAs可以在其他物種中找到同源序列，隨機(jī)選取其中的

9、6個(gè)新miRNAs（NS-1、NS-2、NS-3、NS-6、NS-8和NS-9）進(jìn)行克隆測(cè)序，證明了這些miRNAs確實(shí)存在于豬中。誘導(dǎo)表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，NS-2、NS-8和NS-9在不同濃度Poly(I∶ C)刺激下表達(dá)量變化顯著(p＜0.05);組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，NS-2、NS-8和NS-9在1月齡民豬13個(gè)組織中（心、肝、脾、肺、腎、胃、舌、膀胱、小腸、大腸、脂肪、背最長(zhǎng)肌和皮膚）均表達(dá)，但表達(dá)模式各不相同。⑹細(xì)胞生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)證明，過

10、表達(dá)miR-20a可以縮短pk15細(xì)胞在生長(zhǎng)遲緩區(qū)停留的時(shí)間，提前進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段，顯著促進(jìn)細(xì)胞的增殖(p＜0.05)，抑制miR-20a的表達(dá)會(huì)顯著減緩細(xì)胞的增殖(p＜0.05);細(xì)胞劃痕試驗(yàn)證明過表達(dá)miR-20a后，各觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)pk15細(xì)胞的相對(duì)遷移率均顯著高于對(duì)照組(p＜0.05)，抑制miR-20a的表達(dá)會(huì)顯著降低細(xì)胞的遷移率(p＜0.05)。⑺Real-time PCR檢測(cè)miR-20a對(duì)5個(gè)細(xì)胞因子(IFN-β、IL-29