G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)雄激素對(duì)前列腺癌細(xì)胞快速作用的非基因組機(jī)制.pdf

1、目的：體外研究G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的雄激素(雙氫睪酮，DHT)對(duì)人前列腺癌PC3細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)活性產(chǎn)生的快速非基因組效應(yīng)，并探討其機(jī)制。方法：應(yīng)用鈣熒光指示劑Fura-2/AM檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]i)；Westernblot方法檢測(cè)MAPK家族成員(ERK1/2、JNK和p38)的活化水平；MTTassay檢測(cè)DHT快速作用對(duì)細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果：DHT可以在一定范圍內(nèi)濃度依賴性地誘導(dǎo)PC

2、3細(xì)胞[Ca2+]i快速升高，而且也能快速誘導(dǎo)ERK1/2、JNK的磷酸化，但是對(duì)p38的磷酸化卻表現(xiàn)為快速的抑制作用；當(dāng)細(xì)胞外無(wú)Ca2+或使用L-型鈣離子通道阻斷劑預(yù)處理細(xì)胞，DHT不能誘導(dǎo)這種快速效應(yīng)；用AR拮抗劑醋酸環(huán)丙氯地孕酮預(yù)處理細(xì)胞，對(duì)該快速效應(yīng)無(wú)影響；用蛋白合成抑制劑放線菌酮預(yù)處理細(xì)胞，DHT仍能誘導(dǎo)[Ca2+]i快速升高；用睪酮-牛血清白蛋白復(fù)合物(短期內(nèi)不能穿過(guò)細(xì)胞膜)刺激細(xì)胞，仍能誘導(dǎo)[Ca2+]i快速升高；用G蛋白

3、抑制劑百日咳毒素或GDPβs預(yù)處理細(xì)胞，能明顯阻斷DHT誘導(dǎo)的快速效應(yīng)；DHT短暫的脈沖式刺激對(duì)PC3細(xì)胞的增殖具有一定的促進(jìn)作用。結(jié)論：雄激素對(duì)前列腺癌細(xì)胞存在著由細(xì)胞膜G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)介導(dǎo)的快速非基因組效應(yīng)。雄激素通過(guò)GPCR能促使細(xì)胞膜L-型電壓門控通道開放，引起胞外Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+濃度的快速升高，然后進(jìn)一步引起MAPK激酶活性的快速變化。DHT通過(guò)非基因組作用快速調(diào)節(jié)MAPK激酶活性可能是其促進(jìn)PC3細(xì)胞

4、增殖的機(jī)制之一。這種雄激素快速作用的非基因組機(jī)制可能在前列腺癌的惡性演變過(guò)程中扮演著一個(gè)重要的角色，同時(shí)對(duì)前列腺癌的治療也具有重要的臨床價(jià)值。 研究背景：雄激素在體內(nèi)具有重要的生理功能，能促進(jìn)男性的第二性征的發(fā)育和成熟以及男性生殖器官的維持和精子的發(fā)生。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為，人體內(nèi)主要的雄激素睪酮(T)和它的代謝產(chǎn)物5α-雙氫睪酮(DHT)一般是通過(guò)經(jīng)典的基因組機(jī)制發(fā)揮它們的生物效應(yīng)，即雄激素進(jìn)人靶細(xì)胞后和胞內(nèi)雄激素受體(AR)結(jié)合，使

5、AR活化形成二聚體，然后作用于特定的基因位點(diǎn)或其它轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，進(jìn)而影響mRNA的表達(dá)和蛋白質(zhì)的合成。通過(guò)這種機(jī)制發(fā)揮作用的特點(diǎn)是起效慢而持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。前列腺癌的激素治療正是以此為理論依據(jù)。然而除了這種基因組作用模式，有越來(lái)越多的證據(jù)顯示：雄激素對(duì)機(jī)體多種組織和細(xì)胞存在不依賴傳統(tǒng)基因組途徑的快速作用，例如快速誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子(Ca2+)的增加。這種快速作用不經(jīng)過(guò)胞內(nèi)受體，也不涉及任何基因的轉(zhuǎn)錄或蛋白質(zhì)的合成，屬于一種非基因組作用機(jī)制。

6、這種非基因組的作用機(jī)制與傳統(tǒng)的基因組作用機(jī)制相比較具有如下特點(diǎn)：①起效時(shí)間短，往往在數(shù)秒至數(shù)分鐘即出現(xiàn)效應(yīng)；②雄激素受體拮抗劑、DNA轉(zhuǎn)錄和蛋白合成抑制劑均不能阻斷該作用；③雄激素與大分子物質(zhì)(如BSA)偶聯(lián)后短時(shí)間內(nèi)不能進(jìn)人細(xì)胞，但仍能發(fā)揮其快速效應(yīng)。因此，研究雄激素在前列腺癌細(xì)胞中的非基因組作用機(jī)制以及這種快速作用對(duì)腫瘤細(xì)胞功能的影響，有助于我們進(jìn)一步揭示前列腺癌的惡性演變過(guò)程，同時(shí)對(duì)前列腺癌的治療也具有重要的臨床價(jià)值。 目

7、的：體外研究雄激素(雙氫睪酮，DHT)對(duì)人前列腺癌PC3細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)活性產(chǎn)生的快速非基因組效應(yīng)，并探討其機(jī)制。同時(shí)觀察這種快速作用對(duì)細(xì)胞增殖的影響。 方法：復(fù)蘇、培養(yǎng)人前列腺癌PC3細(xì)胞株。應(yīng)用鈣熒光指示劑Fura-2/AM和MiraCalimagesystem檢測(cè)DHT對(duì)PC3細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]i)的快速影響；用Westernblot方法檢測(cè)MAPK家族成員(ERK1/2、JN

8、K和p38)的磷酸化水平，觀察DHT對(duì)PC3細(xì)胞內(nèi)MAPK激酶活性的快速調(diào)節(jié)作用；MTTassay檢測(cè)DHT快速作用對(duì)前列腺癌PC3細(xì)胞增殖的影響。 結(jié)果：1、DHT可以誘導(dǎo)PC3細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i快速升高，同時(shí)也能快速誘導(dǎo)ERK1/2、JNK的磷酸化，但是對(duì)p38的磷酸化卻表現(xiàn)為快速的抑制作用。DHT濃度在10-7～10-9M時(shí)這種快速作用依次減弱，并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。10-6MDHT引起的快速效應(yīng)與10-7MDHT相比無(wú)明

9、顯差異。DHT濃度在10-9M時(shí)沒有引起細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i和MAPK活性的明顯變化。2、當(dāng)細(xì)胞外無(wú)Ca2+時(shí)，DHT不能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i快速升高，而且使用L-型鈣離子通道阻斷劑verapamil、diltiazem和nifedipine預(yù)處理細(xì)胞也可抑制DHT誘導(dǎo)的[Ca2+]i快速升高效應(yīng)，但使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)RyR抑制劑普魯卡因和磷脂酶C抑制劑新霉素對(duì)該快速效應(yīng)無(wú)影響。3、在細(xì)胞外無(wú)Ca2+的條件下，DHT也不能引起ERK1/2、

10、JNK和p38磷酸化水平的快速變化。4、用雄激素受體拮抗劑醋酸環(huán)丙氯地孕酮預(yù)處理細(xì)胞，對(duì)DHT誘導(dǎo)[Ca2+]i快速升高和快速調(diào)節(jié)MAPK激酶活性的效應(yīng)均無(wú)影響。5、使用蛋白合成抑制劑放線菌酮預(yù)處理細(xì)胞后，DHT仍能誘導(dǎo)[Ca2+]i快速升高。6、用睪酮-牛血清白蛋白復(fù)合物(T-BSA，短期內(nèi)不能穿過(guò)細(xì)胞膜)刺激細(xì)胞后，仍能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i快速升高。7、使用G蛋白抑制劑百日咳毒素(PTX)或GDPβs預(yù)處理細(xì)胞，能明顯阻斷DHT

11、對(duì)細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i和MAPK激酶活性的快速作用。8、用1μMDHT刺激PC3細(xì)胞兩次，每次持續(xù)20min，兩次時(shí)間間隔2h，然后用去激素的小牛血清繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48h后檢測(cè)增殖情況，與對(duì)照組相比，單次DHT刺激沒有引起細(xì)胞數(shù)的明顯改變，但給予兩次(脈沖式)刺激后細(xì)胞數(shù)有顯著增加。 結(jié)論：1、DHT能夠誘導(dǎo)前列腺癌PC3細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i快速升高，并對(duì)細(xì)胞內(nèi)MAPK激酶活性產(chǎn)生快速的調(diào)節(jié)作用，這種快速效應(yīng)在一定范圍內(nèi)具有濃度依

12、賴性。2、胞內(nèi)快速增加的Ca2+來(lái)源于細(xì)胞外的Ca2+通過(guò)細(xì)胞膜L-型電壓門控通道內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)未參與作用。3、DHT對(duì)細(xì)胞內(nèi)ERK1/2、JNK和p38磷酸化水平的快速調(diào)節(jié)作用是Ca2+依賴的，胞內(nèi)[Ca2+]i的快速升高是MAPK激酶活性產(chǎn)生快速變化的必要條件。4、DHT引起的這種快速效應(yīng)不是通過(guò)經(jīng)典AR介導(dǎo)的，其過(guò)程中不需要蛋白質(zhì)合成，而是通過(guò)非基因組機(jī)制完成的，與G蛋白的活化密切相關(guān)。5、該快速效應(yīng)是通過(guò)細(xì)胞膜上雄激素結(jié)合位點(diǎn)

13、介導(dǎo)的，這種細(xì)胞膜上的雄激素結(jié)合位點(diǎn)屬于G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)或同G蛋白偶聯(lián)受體的功能密切相關(guān)。6、DHT通過(guò)短暫的脈沖式刺激對(duì)PC3細(xì)胞的增殖產(chǎn)生了一定的促進(jìn)作用，提示DHT可以通過(guò)快速的非基因組作用促進(jìn)前列腺癌PC3細(xì)胞的增殖。7、DHT通過(guò)非基因組途徑對(duì)MAPK激酶活性的快速調(diào)節(jié)可能是其影響PC3細(xì)胞增殖的機(jī)制之一。8、這種雄激素快速作用的非基因組機(jī)制可能在前列腺癌的惡性演變過(guò)程中起著重要的作用，同時(shí)對(duì)前列腺癌的治療也具有重要