RNAi抑制食管癌細胞系ECA109端粒酶活性的實驗研究.pdf

1、端粒是真核細胞線性染色體末端特殊的DNA-蛋白質復合體結構，有維持染色體穩(wěn)定和基因組完整的功能，隨細胞的分裂不斷縮短，直至染色體丟失、融合、重組和降解，發(fā)生細胞凋亡，因而被稱為細胞分裂的“生物鐘”。端粒酶是一種逆轉錄酶，能以自身的RNA為模板合成端粒的DNA重復序列(5-TTAGGG-3)n加在染色體末端，維持端粒長度，使細胞發(fā)生永生化或變成癌細胞。端粒酶在85％以上的惡性腫瘤組織中陽性表達，而在正常體細胞中則一般為陰性。把端粒酶作為腫

2、瘤治療的靶點具有良好的應用前景。目前研究認為人端粒酶復合體主要由人端粒酶RNA(human telomeraseRNA,hTR)和人端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reversetranscriptase,hTERT)組成。最近研究報道hTERT既是影響端粒酶活性的最重要部分，也是端粒酶活性的限速因子。因此，靶向hTERT顯然更為理想。其中重要的方法有反義核酸技術封閉、錘頭狀核酶切割和抑制hTERT的轉錄等。RNA干擾

3、(RNA interference,RNAi)是指由特定雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)引起的轉錄后基因沉默現(xiàn)象。研究表明，Dicer核酸酶(Dicer RNase L)斷裂dsRNA產(chǎn)生的小干涉RNA可以抑制哺乳動物體細胞和胚胎中的基因的表達。RNA依賴的RNA聚合酶(RNA dependent RNApolymerase，RdRP)在擴增RNAi中起著關鍵性的作用，RdRP活性復制較長觸發(fā)性dsRNA

4、或以一種非引物的方式復制小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)，即以siRNA為引物的RdRP反應使靶mRNA轉變?yōu)閐sRNA，同時復制觸發(fā)性dsRNA。所有的產(chǎn)物又可作為Dicer的底物，起始RdRP級聯(lián)反應。 目的：研究載體介導RNAi技術對食管癌細胞系ECA109端粒酶及hTERT mRNA表達的抑制作用，探討RNAi抑制腫瘤細胞的作用及機理。 方法：根據(jù)Gene bank中報道的h

5、TERT的核苷酸序列，參考siRNA的設計策略，通過基因blast，挑選3條目的hTERT基因的siRNA序列：Ⅰ：TTGCAAAGCATTGGAATCA，Ⅱ：AGAACGTTCCGCAGAGAA，Ⅲ：GTACAGGTTTCACGCATGT構建干擾質粒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及空質粒，并將其分別轉染食管癌細胞系ECA109，熒光顯微鏡觀察轉染效果；24h、48h末端重復片斷擴增．酶聯(lián)免疫吸附(TRAP-ELJSA)方法測定細胞端粒酶活性，篩選出高效抑

6、制端粒酶活性的hTERT siRNA，RT-PCR觀察ECA109細胞中hTERT mRNA表達改變。 結果：1重組質粒和空質粒酶切鑒定：經(jīng)BamH Ⅰ和HindⅢ酶切后干擾質粒插入片段為110bp左右，空質粒插入片段為70bp左右。 2 質粒轉染細胞24h、48h后熒光顯微鏡觀察各轉染組均見有綠色熒光的細胞，約占細胞總數(shù)的50％-60％。 3 端粒酶活性測定：干擾質粒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及空質粒轉染ECA109細胞后端粒

7、酶活性數(shù)值：24h端粒酶活性均數(shù)依次為：0.417±0.023，0.189±0.025，0.435±0.034與對照組均數(shù)0.879±0.036比較，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ均有顯著性差異(P<0.05)。48h端粒酶活性均數(shù)依次為：0.435±0.032，0.177±0.020，0.395±0.021與對照組均數(shù)0.847±0.027比較，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組均有顯著性差異(P<0.05)。各干擾質粒的抑制率：48h各干擾質粒的抑制率：干擾組Ⅰ抑制率=49

8、％，干擾組Ⅱ抑制率=79％，干擾組Ⅲ抑制率=53％，Ⅱ組抑制率最高。 4 半定量RT-PCR結果4.1 RNA電泳結果：顯示18s，28s條帶完整、清晰，28s帶的寬度及亮度約是18s的2倍左右。 4.2 hTERT和β-actin的擴增基因經(jīng)電泳，結果顯示擴增片段大小與所設計的大小完全一致，分別為198 bp和621bp，重組質粒Ⅱ轉染的ECA109中hTERT-mRNA的表達較空質粒轉染的ECA109中hTERT-mRNA表

9、達量顯著下降，hTERT擴增產(chǎn)物強度與內對照β-actin的比值在對照組和實驗組分別為0.9323±0.0155，0.5167±0.01922，有顯著性差異(P<0.01，n=4)。實驗組降低為對照組的55.4％。 結論：成功構建載體介導的hTERT靶向RNA干擾重組體，能有效抑制食管癌細胞系ECA109端粒酶活性及hTERT-mRNA表達，確定特異性抑制端粒酶活性的siRNA靶點，為進一步開發(fā)抗腫瘤新藥和基因治療提供試驗和理論