應用EGS基因沉默技術研究人巨細胞病毒臨床病毒株UL148基因功能.pdf

1、目的：
　　 研究外部引導序列（External Guide Sequences，EGS）對人巨細胞病毒（Human Cytomegalovirus，HCMV）臨床病毒株UL148基因表達的抑制作用，為探討UL148基因功能奠定基礎，為抗HCMV治療尋找新的治療途徑。
　　 方法：
　　 細胞外實驗：1.根據(jù)靶基因UL148序列特征設計并合成DNA性質EGS；2.從HCMV臨床病毒株基因組中擴增UL148基因，克

2、隆入pGEM-T-EASY質粒，PCR擴增UL148小片段，制備底物轉錄模板，參入32P-UTP后體外轉錄；3.從大腸桿菌DH5α基因組擴增M1RNA基因，將其克隆入pUC18質粒，線性化后，體外合成M1RNA；4.將底物UL148 RNA、EGS、M1RNA混合于切割反應液，37℃反應1h，以聚丙烯酰胺凝膠分離產(chǎn)物，應用Typhoons掃描儀分析切割結果。
　　 細胞內(nèi)實驗：將UL148基因克隆入pEGFP-N1質粒，重組質粒

3、轉染HeLa細胞，同時以pEGFP-N1質粒轉染HeLa細胞作為陰性對照，均以1mg/mL G418篩選4周。選取細胞外實驗證實有切割作用的EGS4，分別以50nM、100nM、200nM、400nM終濃度轉染G418篩選后的細胞。應用熒光顯微鏡觀察上述細胞熒光量的變化；應用熒光定量PCR進行絕對定量，分析EGS4對UL148表達量的沉默效果。
　　 結果：
　　 細胞外實驗：1.共設計5條EGS；2.成功構建pT148

4、重組質粒，PCR后擴增獲得UL148小片段轉錄模板，經(jīng)體外轉錄獲得32P標記的UL148小片段RNA；3.成功構建pUC-M1重組質粒，線性化后，體外轉錄合成M1RNA；4.在細胞外進行切割實驗，篩選出多條具有特異性切割UL148 RNA的EGS。
　　 細胞內(nèi)實驗：成功構建p148-EGFP重組質粒；重組質粒p148-EGFP及pEGFP-N1質粒分別轉染HeLa細胞，經(jīng)G418篩選后，成功構建穩(wěn)定表達UL148基因的HeLa

5、細胞系（UL148-HeLa）和穩(wěn)定表達EGFP的HeLa細胞系（EGFP-HeLa）。熒光顯微鏡觀察50nM、100nM、200nM、400nM的EGS4作用后，UL148-HeLa細胞的熒光量明顯減少，而EGFP-HeLa細胞熒光量無明顯改變。熒光定量PCR分析顯示50nM、100nM、200nM、400nM EGS4對UL148的抑制效率分別為74.9％(P<0.05)、78.6％(P<0.05)、81.1％(P<0.05)、87

6、.0％(P<0.05)。
　　 結論：
　　 1.經(jīng)細胞外實驗篩選出2條具有特異性切割UL148 RNA作用的EGS，分別為EGS1和EGS4；
　　 2.在細胞內(nèi)EGS4能有效沉默HCMV UL148基因的表達，并隨濃度的增加，沉默效果逐漸明顯；
　　 3.細胞外EGS切割實驗系統(tǒng)可作為細胞內(nèi)切割實驗前的一種有效篩選途徑；
　　 4.經(jīng)細胞外和細胞內(nèi)切割實驗篩選出的有效EGS,可用于研究UL14