病毒誘導(dǎo)的基因沉默體系及小麥SBEIIb基因功能的研究.pdf

1、VIGS（virus induced gene silencing，VIGS）技術(shù)是一種RNA介導(dǎo)的植物防御機(jī)制，是指攜帶目的基因片段的載體病毒進(jìn)入植物后，可誘導(dǎo)植物內(nèi)源基因沉默，其分子基礎(chǔ)可能是轉(zhuǎn)錄后基因沉默PTGS(post-transcript gene silence，PTGS)。VIGS被視為研究植物基因功能的強(qiáng)有力工具。大麥條紋花葉病毒(barley stripe mosaic virus，BSMV)，由于其寄主范圍廣而成為

2、單子葉植物優(yōu)良的載體，為小麥基因功能的研究提供了有效的工具。為了給以后利用VIGS技術(shù)開展小麥淀粉合成酶基因功能的研究提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)，本研究選擇小麥PDS(Phytoene Desaturase)基因與淀粉合成關(guān)系較密切的SBEIIb(Starch-branching enzyme IIb)基因?yàn)榘谢?，以PDS基因?yàn)橹甘净?，分別構(gòu)建目的基因片段的BSMV-VIGS載體，接種在小麥葉片和幼穗上，在不同溫度條件、接種方法、接種量

3、的處理下，誘發(fā)植物發(fā)生基因沉默，并對(duì)其進(jìn)行定性定量分析，建立小麥穗部相對(duì)最優(yōu)的VIGS體系，并利用該體系進(jìn)行了SBEIIb基因功能的初步研究。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴克隆了小麥PDS基因片段和SBEIIb基因片段，并構(gòu)建其VIGS重組載體。⑵選擇注射法和摩擦法分別侵染抽穗期的小麥穗部，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用兩種方法接種的植株均在5-8 dpi(days post infection)出現(xiàn)明顯的光漂白現(xiàn)象，在15 dpi光漂白現(xiàn)象明顯擴(kuò)

4、大，在23-26 dpi光漂白程度最大。采用注射法接種的侵染成功率只有20％，而摩擦法接種的侵染成功率為90%。接種旗葉的表型變化與接種穗部的相似。由于基因沉默延遲，在接種旗葉20 dpi左右，穗部才觀察到光漂白現(xiàn)象。采用摩擦法接種小麥幼穗后，放在21-24℃和26-29℃的不同溫度下培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在兩個(gè)環(huán)境中培養(yǎng)的植株病毒侵染成功率均在90%左右。在26-29℃較高溫度下，病毒發(fā)展過快，癥狀過重，掩蓋了基因沉默的光漂白表型，并且發(fā)生

5、了其他的嚴(yán)重病害，影響了接種材料表型觀察及分子檢測(cè)。此外，在26-29℃環(huán)境下的植株還表現(xiàn)出灌漿不充分和不能結(jié)實(shí)的現(xiàn)象。接種次數(shù)對(duì)VIGS誘導(dǎo)基因沉默的影響只是提高了接種成功率，其他并無明顯變化。因此，選擇摩擦法接種小麥穗部，在21-24℃培養(yǎng)更優(yōu)。⑶選取出現(xiàn)光漂白植株的小穗及相應(yīng)時(shí)期的對(duì)照組進(jìn)行色素含量測(cè)定及 PDS基因相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定。結(jié)果顯示，葉綠素a及類胡蘿卜素的含量均在20 dpi分別下降83.6%和91.4%。葉綠素b的含量

6、在12-20 dpi減少超過60%。在20 dpi前后，葉綠素總含量減少80.5%。在接種后3 d PDS基因相對(duì)表達(dá)量下降了50%左右，在第9-20 dpi，維持在一個(gè)相對(duì)較低的水平（約10%），在25 dpi之后有所上升。說明葉綠素含量的降低是由PDS基因沉默引起的。⑷在小麥抽穗期，將攜帶SBEⅡb的BSMV侵染小麥，在接種后第6，9，12，15和20 d分別提取總RNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，SBEⅡb