結(jié)締組織生長(zhǎng)因子對(duì)胰腺癌細(xì)胞和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡影響的作用機(jī)制探討.pdf

1、目的： 第一部分：構(gòu)建人結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)基因真核表達(dá)載體，并在哺乳類Cos7細(xì)胞中獲得表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物具有促進(jìn)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)增殖的生物活性。從而為進(jìn)一步研究CTGF基因在血管新生和腫瘤中的作用奠定基礎(chǔ)。 第二部分：(1)探討TGFβ1、內(nèi)源性CTGF、外源性CTGF對(duì)胰腺癌細(xì)胞Panc-1增殖、凋亡以及細(xì)胞周期的影響。(2)研究CTGF在胰腺癌細(xì)胞Panc-1中的表達(dá)情況以及TGFβ1對(duì)CTG

2、F基因表達(dá)的影響。(3)探討CTGF單克隆抗體對(duì)TGFβ1促凋亡的抑制作用。(4)研究CTGF促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞Panc-1凋亡的作用機(jī)制，探討CTGF的表達(dá)與胰腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的關(guān)系。 第三部分：(1)CTGF對(duì)HUVECs增殖的影響;(2)探討CTGF對(duì)HUVECs細(xì)胞磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI-3K/PKB)信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活作用以及PI-3K抑制劑(LY294002)對(duì)其影響;(3)研究CTGF對(duì)HUVECs細(xì)胞細(xì)

3、胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)信號(hào)通路的影響以及p-ERK抑制劑(U0126)對(duì)其影響。 方法： 第一部分：根據(jù)人CTGF基因的cDNA序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)5，端分別含有XbaⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)的特異性引物，運(yùn)用RT-PCR方法擴(kuò)增HUVECs中CTGF，回收PCR產(chǎn)物，并將其連接至克隆載體PMD-18T中。重組的PMD-18T在大腸桿菌DH5α內(nèi)擴(kuò)增后，經(jīng)質(zhì)粒提取、XbaⅠ和HindⅢ酶切，篩選出陽(yáng)性重組子，并測(cè)序鑒定基

4、因。瓊脂糖凝膠電泳回收含有CTGFcDNA全長(zhǎng)的酶切片段，然后在DNA連接酶作用下將其與真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)連接。重組質(zhì)粒經(jīng)XbaⅠ和HindⅢ酶切予以鑒定。并將其轉(zhuǎn)染到Cos7細(xì)胞中，用westernblotting法證實(shí)其表達(dá)。以MTT檢測(cè)轉(zhuǎn)染上清對(duì)HUVECs的增殖影響。 第二部分：脂質(zhì)體介導(dǎo)CTGF真核表達(dá)載體pcDNA3.1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞系Panc-1。MTT法檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞的增殖情況。流式細(xì)胞儀檢測(cè)

5、胰腺癌細(xì)胞系Panc-1的凋亡情況以及細(xì)胞周期的變化。RT-PCR和Westernblot法檢測(cè)外源性CTGF刺激后細(xì)胞內(nèi)的Bcl-2和Bax的基因和蛋白的表達(dá)情況。以及RT-PCR法檢測(cè)TGFβ1對(duì)CTGF基因表達(dá)的影響。 第三部分：應(yīng)用免疫磁珠篩選臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，免疫組織化學(xué)法和電鏡鑒定內(nèi)皮細(xì)胞，MTT法鑒定結(jié)締組織生長(zhǎng)因子對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞儀測(cè)定CTGF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞周期的影響。以WesternBlot法檢測(cè)一定濃

6、度(100ng/ml)CTGF作用于HUVECs不同時(shí)間0min，15min，30min，60min后和不同濃度(0、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml和100ng/ml)CTGF作用HUVECs細(xì)胞一定時(shí)間(30min)后ERK、p-ERK、Akt、p-Akt蛋白的變化以及用同法檢測(cè)PI-3K抑制劑LY294002以及p-ERK抑制劑U0126分別對(duì)CTGF作用于p-ERK和p-Akt的影響。 結(jié)論： 1.

7、成功構(gòu)建人結(jié)締組織生長(zhǎng)因子CTGF基因的真核表達(dá)載體。并且其表達(dá)產(chǎn)物具有促進(jìn)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的活性。 2.TGFβ1促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可能與CTGF的表達(dá)有關(guān)，而CTGF的作用可顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖能力和促進(jìn)其凋亡，并且這種促凋亡機(jī)制可能與Bax的表達(dá)有關(guān)。 3.CTGF可通過非轉(zhuǎn)錄效應(yīng)，迅速激活HUVECs細(xì)胞的PI-3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路以及ERK信號(hào)通路。LY294002和U0126可抑制CTGF對(duì)此通路的激活