鴨星狀病毒1型D51株DNA-launched感染性克隆的構建與病毒拯救.pdf

1、星狀病毒（Astrovirus,AstV）是一種感染人及豬、牛、蝙蝠、犬、貓等哺乳動物和雞、火雞、鴿子等鳥類的腸道疾病相關病原。鴨星狀病毒屬于星狀病毒科禽星狀病毒屬，是一種單股正鏈、沒有囊膜的RNA病毒。3周齡以內的雛鴨易感，不同于其他的禽星狀病毒，鴨星狀病毒可以導致鴨的致死性的病毒性肝炎，表現為肝臟出血，抽搐和角弓反張等神經癥狀。最近幾年研究發(fā)現，鴨星狀病毒和鴨甲肝病毒混合感染的情況頻繁出現，使鴨病毒性肝炎的防治難度進一步增加。為了深

2、入了解鴨星狀病毒的基因組結構和功能以及致病機理等，本研究的目的是構建鴨星狀病毒I型（Duck astrovirus type1,DAstV-1）D51株cDNA DNA-lauched感染性克隆，對拯救病毒在BHK-21細胞中的增殖情況進行探究，并對D51拯救病毒在鴨子體內的分布情況利用熒光定量的方法進行了檢測。
　　1.ORF2蛋白的原核表達及抗DAstV-1血清的制備
　　為了進行DAstV-1的IFA鑒定，本研究需要制

3、備抗DAstV-1血清。首先將DAstV-1的衣殼蛋白基因（ORF2）分三段克隆到原核表達載體pET-32a中，轉化到大腸桿菌BL21（DE3）中誘導表達出融合蛋白。將融合蛋白與弗氏完全佐劑混合后免疫BALB/C老鼠，分別間隔兩周后，將融合蛋白與弗氏不完全佐劑混合后進行二免、三免，三免十天后采血離心后得到三份抗血清，檢測發(fā)現抗血清3的P/N值最大，適于進行DAstV-1的IFA鑒定。
　　2.DAstV-1 D51株傳染性克隆的構

4、建以及病毒的拯救
　　在本實驗室已完成的DAstV-1 D51株全基因組測序基礎上，根據pABX.載體序列、核酶序列和病毒全基因組序列的酶切圖譜，設計并合成四對特異性引物，將已有的11段片段通過融合PCR的方法融合成四段A、B、C、D，通過引物的形式把核酶序列分別添加在第一段的前端和第四段的末端，并在末端添加病毒基因組序列中不存在的單一酶切位點Xhol。首先將A、B片段分別連接在pEASY-T1載體上，C、D片段連接在pMD18-

5、T載體上；然后將A、B片段通過AscI、BamHI酶切位點連在同一個pEASY-T1載體上；最后，通過特異的酶切位點依次將AB、C、D片段依次連接在克隆載體中，組成了一個包含全長cDNA的質粒，并將其命名為pABX-DAstV。另外設計一對引物，用于突變一個堿基（6234為C突變?yōu)門）形成BglII酶切位點作為遺傳標簽，用于區(qū)分母本病毒和拯救病毒。將獲得的pABX-DAstV質粒測序后，發(fā)現有1個堿基發(fā)生突變，而且是人為突變，氨基酸并沒

6、有發(fā)生變化。將大量提取的去毒素重組質粒pABX-DAstV轉染BHK-21細胞，用滅菌PBS作陰性對照。用RT-PCR和IFA方法檢測結果均為陽性。通過鑒定突變的遺傳標記，表明已經成功獲得了拯救病毒。
　　3.D51毒株在細胞中增殖的探究
　　由于沒有合適的細胞系可以增殖星狀病毒，因此對星狀病毒的研究具有一定的局限性。由于人星狀病毒可以在胰酶存在的情況下進行增殖，本研究摸索了鴨星狀病毒的傳代方法。將DNA-launched感

7、染性克隆質粒轉染BHK-21細胞培養(yǎng)72小時之后，反復凍融三次，用200μg/mL的trypsin在37℃處理1h，然后將細胞毒用胰酶抑制劑處理1h，加到長到80％匯合度細胞的細胞瓶中孵育1h，之后換上含3μg/mL trypsin的不含血清的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，并可傳代。
　　4.SYBR Green I熒光定量PCR方法的建立與應用
　　通過設計特異性引物建立了檢測DAstV-1的SYBR Green I熒光定量PCR方法

8、。建立了檢測 DAstV-1的標準曲線，在7.3×109～7.3×102 copies/μL范圍內具有良好線性關系，標準曲線方程為 Y=-3.4811x+38.429，相關系數分別為0.999，PCR循環(huán)效率分別為94.4%，檢測發(fā)現該方法具有良好的重復性和特異性，靈敏度為73copies/PCR。用重組質粒轉染BHK-21細胞得到的拯救病毒，接種2日齡的健康雛鴨，分別在接種后24h、36h、48h三個時間點取其心、肝、脾、腎、胸腺、法

9、氏囊、小腸七個器官用建立的熒光定量方法進行檢測。研究結果表明每個器官中都可以檢測到拯救病毒，顯示拯救病毒可以在鴨子體內多個不同的組織器官中增殖。
　　星狀病毒（Astrovirus,AstV）是一種感染人及豬、牛、蝙蝠、犬、貓等哺乳動物和雞、火雞、鴿子等鳥類的腸道疾病相關病原。鴨星狀病毒屬于星狀病毒科禽星狀病毒屬，是一種單股正鏈、沒有囊膜的RNA病毒。3周齡以內的雛鴨易感，不同于其他的禽星狀病毒，鴨星狀病毒可以導致鴨的致死性的病毒

10、性肝炎，表現為肝臟出血，抽搐和角弓反張等神經癥狀。最近幾年研究發(fā)現，鴨星狀病毒和鴨甲肝病毒混合感染的情況頻繁出現，使鴨病毒性肝炎的防治難度進一步增加。為了深入了解鴨星狀病毒的基因組結構和功能以及致病機理等，本研究的目的是構建鴨星狀病毒I型（Duck astrovirus type1,DAstV-1）D51株cDNA DNA-lauched感染性克隆，對拯救病毒在BHK-21細胞中的增殖情況進行探究，并對D51拯救病毒在鴨子體內的分布情況

11、利用熒光定量的方法進行了檢測。
　　1.ORF2蛋白的原核表達及抗DAstV-1血清的制備
　　為了進行DAstV-1的IFA鑒定，本研究需要制備抗DAstV-1血清。首先將DAstV-1的衣殼蛋白基因（ORF2）分三段克隆到原核表達載體pET-32a中，轉化到大腸桿菌BL21（DE3）中誘導表達出融合蛋白。將融合蛋白與弗氏完全佐劑混合后免疫BALB/C老鼠，分別間隔兩周后，將融合蛋白與弗氏不完全佐劑混合后進行二免、三免，三

12、免十天后采血離心后得到三份抗血清，檢測發(fā)現抗血清3的P/N值最大，適于進行DAstV-1的IFA鑒定。
　　2.DAstV-1 D51株傳染性克隆的構建以及病毒的拯救
　　在本實驗室已完成的DAstV-1 D51株全基因組測序基礎上，根據pABX.載體序列、核酶序列和病毒全基因組序列的酶切圖譜，設計并合成四對特異性引物，將已有的11段片段通過融合PCR的方法融合成四段A、B、C、D，通過引物的形式把核酶序列分別添加在第一段的

13、前端和第四段的末端，并在末端添加病毒基因組序列中不存在的單一酶切位點Xhol。首先將A、B片段分別連接在pEASY-T1載體上，C、D片段連接在pMD18-T載體上；然后將A、B片段通過AscI、BamHI酶切位點連在同一個pEASY-T1載體上；最后，通過特異的酶切位點依次將AB、C、D片段依次連接在克隆載體中，組成了一個包含全長cDNA的質粒，并將其命名為pABX-DAstV。另外設計一對引物，用于突變一個堿基（6234為C突變?yōu)門

14、）形成BglII酶切位點作為遺傳標簽，用于區(qū)分母本病毒和拯救病毒。將獲得的pABX-DAstV質粒測序后，發(fā)現有1個堿基發(fā)生突變，而且是人為突變，氨基酸并沒有發(fā)生變化。將大量提取的去毒素重組質粒pABX-DAstV轉染BHK-21細胞，用滅菌PBS作陰性對照。用RT-PCR和IFA方法檢測結果均為陽性。通過鑒定突變的遺傳標記，表明已經成功獲得了拯救病毒。
　　3.D51毒株在細胞中增殖的探究
　　由于沒有合適的細胞系可以增殖

15、星狀病毒，因此對星狀病毒的研究具有一定的局限性。由于人星狀病毒可以在胰酶存在的情況下進行增殖，本研究摸索了鴨星狀病毒的傳代方法。將DNA-launched感染性克隆質粒轉染BHK-21細胞培養(yǎng)72小時之后，反復凍融三次，用200μg/mL的trypsin在37℃處理1h，然后將細胞毒用胰酶抑制劑處理1h，加到長到80%匯合度細胞的細胞瓶中孵育1h，之后換上含3μg/mL trypsin的不含血清的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，并可傳代。
　　

16、4.SYBR Green I熒光定量PCR方法的建立與應用
　　通過設計特異性引物建立了檢測DAstV-1的SYBR Green I熒光定量PCR方法。建立了檢測 DAstV-1的標準曲線，在7.3×109～7.3×102 copies/μL范圍內具有良好線性關系，標準曲線方程為 Y=-3.4811x+38.429，相關系數分別為0.999，PCR循環(huán)效率分別為94.4%，檢測發(fā)現該方法具有良好的重復性和特異性，靈敏度為73cop