PRRSV HuN4株和CH-1a株感染性克隆及其嵌合病毒的構建及其初步應用.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種病毒性傳染病，臨床上主要表現(xiàn)為妊娠母豬的繁殖障礙和仔豬的呼吸道疾病，因其可引起發(fā)病豬耳部發(fā)紺成藍紫色，俗稱藍耳病。目前我國流行的高致病性藍耳病（HP-PRRS）比經典PRRS致病性更高，危害更大。雖然對PRRSV進行了廣泛的研究，但決定其復制和毒力等的相關機制尚不夠清楚。感染性克隆是研究PRRSV的重要操作平臺，目前大部分的PRRSV感染性克隆是基于體外轉錄

2、的，這不僅降低了拯救的效率，而且增加了病毒拯救的復雜程度。
　　為高效快速地拯救PRRSV，本研究開展了基于真核啟動子的PRRSV反向遺傳的構建。通過RT-PCR方法分段擴增了高致病性PRRSV HuN4-F5和經典PRRSV CH-1a的全長基因組片段，克隆至含β-actin真核啟動子的低拷貝載體pOKM中，成功構建了pOK-HuN4和pOK-Ch兩個全長基因組克隆，經直接轉染Marc-145細胞，成功拯救出相應的病毒。其中pO

3、K-CH的成功構建為PRRSV CH-1a株的保種提供了保證。同時在pOK-HuN4和pOK-CH的基礎上，分別對其結構蛋白和非結構蛋白進行互換，構建了6株嵌合病毒，即以結構蛋白互換的 pOK-HuN4nsp-CHsp和pOK-CHnsp-HuN4sp，非結構蛋白開放閱讀框互換的 pOK-HuN4-CHORF1a、pOK-CH-HuN4ORF1a、pOK-HuN4-CHORF1b和pOK-CH-HuN4ORF1b，并成功拯救出這6株嵌合

4、病毒。在pOK-HuN4的基礎上在其ORF7和3’-UTR之間插入海腎熒光素酶報告基因，經拯救后，可檢測到熒光信號，為PRRSV的復制監(jiān)測及中和抗體水平檢測等方面提供了應用技術。
　　基于真核啟動子的HP-PRRSV HuN4和PRRSV CH-1a株感染性克隆的構建，避免了RNA的體外轉錄，簡化了病毒的拯救過程，提高了病毒拯救的成功率。在此基礎上完成了帶有海腎熒光素酶報告基因的pOK-HuN4-Rlu以及一系列嵌合毒的構建為今后