胸腺淋巴細(xì)胞分化與Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系及六味地黃湯的作用研究.pdf

1、本研究重點(diǎn)觀察了SAMP8增齡過(guò)程中胸腺淋巴細(xì)胞免疫功能的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，進(jìn)而研究了Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路信號(hào)分子基因表達(dá)與胸腺淋巴細(xì)胞分化的關(guān)系，并初步觀察了LW及其拆方對(duì)正常小鼠和SAMP8胸腺淋巴細(xì)胞亞群及Notch通路信號(hào)分子基因表達(dá)的影響，其目的在于探討衰老過(guò)程中免疫系統(tǒng)的衰老與Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系，從而進(jìn)一步認(rèn)識(shí)免疫衰老的機(jī)理及發(fā)展過(guò)程。 本研究分為四個(gè)部分：(1)增齡過(guò)程中SAMP8胸腺結(jié)構(gòu)和T細(xì)胞功能的變化

2、；(2)增齡過(guò)程中SAMP8胸腺淋巴細(xì)胞分化的動(dòng)態(tài)變化；(3)增齡過(guò)程中SAMP8胸腺淋巴細(xì)胞Notch通路信號(hào)分子基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化；(4)LW及其拆方“三補(bǔ)(SB)”和“三瀉(SX)”對(duì)正常小鼠和SAMP8胸腺淋巴細(xì)胞亞群及Notch通路信號(hào)分子基因表達(dá)的影響。 一、增齡過(guò)程中SAMP8胸腺結(jié)構(gòu)和T細(xì)胞功能的變化胸腺是中樞免疫器官，是T細(xì)胞分化成熟的場(chǎng)所，衰老過(guò)程中胸腺的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生明顯變化，以胸腺增齡性萎縮表現(xiàn)尤為明顯。

3、胸腺萎縮又不可避免地影響依賴于胸腺的T細(xì)胞分化，進(jìn)而影響向外周淋巴器官輸出成熟T細(xì)胞的數(shù)量和功能。因此，本研究首先觀察了SAM增齡過(guò)程中胸腺組織結(jié)構(gòu)和胸腺淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的變化。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SAMR1和SAMP8出生后胸腺均逐漸增大，至4周齡時(shí)體積最大，此后開始萎縮，8周齡時(shí)萎縮已十分明顯。在4周齡以前，SAMP8胸腺重量和組織結(jié)構(gòu)與SAMR1相比無(wú)明顯差異。6周齡時(shí)SAMR1和SAMP8的胸腺重量均有所減輕，SAMP8更為

4、明顯，其重量明顯低于SAMR1。組織切片可見SAMP8胸腺皮質(zhì)明顯變薄，細(xì)胞數(shù)量減少；8周齡時(shí)SAMP8胸腺重量進(jìn)一步下降，胸腺皮質(zhì)明顯變薄，細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步減少。上述結(jié)果表明，SAMP8胸腺萎縮明顯早于SAMR1，萎縮程度明顯重于SAMR1。 進(jìn)一步觀察了增齡過(guò)程中SAM胸腺淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的變化。結(jié)果表明，6周齡前SAMR1和SAMP8胸腺淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)均表現(xiàn)為隨增齡而增強(qiáng)，6到8周齡無(wú)明顯變化；1、2周齡時(shí)SAMR1和SA

5、MP8間無(wú)明顯差異，自4周齡開始，SAMP8胸腺淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)能力明顯低于同齡SAMR1，提示其功能開始降低。 二、增齡過(guò)程中SAMP8胸腺淋巴細(xì)胞亞群分化的動(dòng)態(tài)變化小鼠胸腺淋巴細(xì)胞的分化過(guò)程主要是由CD4-CD8-雙陰性(Doublenegative，DN)到CD4+CD8+雙陽(yáng)性(Doublepositive，DP)、再到CD4+(Singlepositive，SP)或CD8+單陽(yáng)性的過(guò)程，其中CD4+單陽(yáng)性是T輔助性細(xì)胞

6、(helperTlymphocyte，Th)，CD8+單陽(yáng)性主要是T抑制性細(xì)胞(suppressorTlymphocyte，Ts)和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CytotoxicTlymphocyte，Tc)，但近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，CD8+單陽(yáng)性細(xì)胞中也含有具有輔助功能的T細(xì)胞亞系。此外，目前普遍認(rèn)為，CD28是免疫細(xì)胞衰老的標(biāo)志性分子。因此，本研究運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)(Flowcytometry，F(xiàn)CM)，觀察了增齡過(guò)程中SAM胸腺淋巴細(xì)胞亞群的變第3頁(yè)

7、化。 結(jié)果表明，在增齡過(guò)程SAMR1和SAMP8胸腺細(xì)胞分化的動(dòng)態(tài)過(guò)程相似。與同齡SAMR1相比，SAMP8胸腺CD4+CD8+雙陽(yáng)性細(xì)胞的比例變化過(guò)程無(wú)明顯差異，CD4+單陽(yáng)性細(xì)胞的比例在6周齡前與SAMR1無(wú)明顯差異，在8周齡時(shí)低于SAMR1，但CD8+單陽(yáng)性細(xì)胞比例在4周齡時(shí)開始明顯高于同齡SAMR1，因而導(dǎo)致其CD4+/CD8+比值降低，提示4周齡時(shí)SAMP8開始出現(xiàn)免疫功能平衡失調(diào)。此外，1至8周齡SAMP8胸腺細(xì)胞CD2

8、8分子的表達(dá)量均明顯高于同齡的SAMR1。提示SAMP8胸腺細(xì)胞的衰老程度明顯高于SAMR1，可能是其亞群分化失調(diào)和功能低下的重要原因之一。 三、SAMP8增齡過(guò)程中胸腺淋巴細(xì)胞Notch通路信號(hào)分子基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化 本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Real-timequantitativereversetranscription-polymerasechainreaction，Real-timequa

9、ntitativeRT-PCR)檢測(cè)了不同周齡SAMP8和SAMR1胸腺淋巴細(xì)胞Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中Notch1、PS1、PS2、HES1基因mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，并分析了它們與CD8+細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化的相關(guān)性。 研究結(jié)果表明，SAM在增齡過(guò)程中胸腺細(xì)胞Notch通路信號(hào)分子的基因表達(dá)發(fā)生了相應(yīng)的變化，其中Notch1、PS2、HES1的表達(dá)隨增齡逐漸增加，而PS1則隨增齡逐漸降低；對(duì)CD8+細(xì)胞比例與上述信號(hào)分子基因表達(dá)進(jìn)行相

10、關(guān)性分析結(jié)果顯示，CD8+細(xì)胞的分化與Notch1、PS2、HES1表達(dá)變化呈正相關(guān)的關(guān)系，而與PS1基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)的關(guān)系，提示衰老過(guò)程中胸腺淋巴細(xì)胞亞群的分化與Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中信號(hào)分子的表達(dá)具有密切關(guān)系，不同信號(hào)分子對(duì)胸腺細(xì)胞分化具有不同的調(diào)節(jié)作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)，SAMP8胸腺細(xì)胞Notch1的表達(dá)在1至8周齡時(shí)均明顯高于同齡SAMR1，PS2和HES1基因均自4周齡起明顯高于同齡SAMR1，而PS1基因自4周齡起則明顯低

11、于同齡SAMR1。提示Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中信號(hào)分子基因表達(dá)異?？赡苁菍?dǎo)致增齡過(guò)程中SAMP8胸腺細(xì)胞功能衰退、亞群分化異常的重要原因之一。 四、LW及其拆方對(duì)不同小鼠胸腺淋巴細(xì)胞亞群及Notch通路信號(hào)分子基因表達(dá)的影響 1.LW及其拆方對(duì)正常小鼠胸腺淋巴細(xì)胞亞群及Notch通路信號(hào)分子基因表達(dá)的影響 (1)對(duì)正常小鼠胸腺淋巴細(xì)胞亞群及CD28表達(dá)的影響分別口服給予4周齡Ba1b/c小鼠LW(5、10及20g

12、/kg)、SB(6.4g/kg)和SX(3.6g/kg)，連續(xù)2周，然后觀察胸腺淋巴細(xì)胞亞群的變化。結(jié)果表明，LW及SB和SX對(duì)正常小鼠CD4+CD8+細(xì)胞和CD4+細(xì)胞的比例均無(wú)明顯影響；三個(gè)劑量的LW均使胸腺CD8+細(xì)胞的比例明顯增高，其中以10g/kg劑量的作用最明顯，并使CD4+/CD8+比值明顯降低。SB和SX對(duì)CD8+細(xì)胞比例無(wú)明顯影響。LW在低、中劑量時(shí)以及SB和SX均能使胸腺淋巴細(xì)胞CD28表達(dá)增加，其中以LW低劑量時(shí)作

13、用最強(qiáng)，大劑量LW對(duì)此則無(wú)明顯影響。 (2)對(duì)正常小鼠胸腺淋巴細(xì)胞Notch通路信號(hào)分子基因表達(dá)的影響LW及SB、SX的給藥劑量和方式同上。結(jié)果表明，LW(5、10及20g/kg)及SB(6.4g/kg)、SX(3.6g/kg)對(duì)正常小鼠胸腺淋巴細(xì)胞Notch1和PS1基因表達(dá)水平無(wú)明顯影響。但三個(gè)劑量的LW均使PS2和HES1基因的表達(dá)水平明顯增高，且具有一定的量效關(guān)系；SB和SX對(duì)PS2、HES1基因的表達(dá)水平無(wú)明顯影響。

14、 2.LW及其拆方對(duì)SAMP8胸腺淋巴細(xì)胞亞群及Notch通路信號(hào)分子基因表達(dá)的影響 (1)對(duì)SAMP8胸腺淋巴細(xì)胞亞群及CD28表達(dá)的影響本實(shí)驗(yàn)觀察了口服給予LW及SB、SX對(duì)4周齡SAMP8胸腺淋巴細(xì)胞亞群的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，連續(xù)4周口服給予LW(10g/kg)及SB(6.4g/kg)、SX(3.6g/kg)，對(duì)SAMP8胸腺CD4+CD8+細(xì)胞比例無(wú)明顯影響。LW可使SAMP8胸腺CD4+細(xì)胞比例有所增加，但無(wú)統(tǒng)計(jì)

15、學(xué)差異；SB和SX對(duì)CD4+細(xì)胞比例無(wú)明顯影響。LW及SB可明顯降低SAMP8胸腺CD8+細(xì)胞比例，使CD4+/CD8+比值增高，但SX對(duì)CD8+細(xì)胞比例無(wú)明顯影響。此外，LW、SB及SX均能明顯增加CD28的表達(dá)，其中以SB(6.4g/kg)的作用最強(qiáng)，LW次之。 (2)對(duì)SAMP8胸腺淋巴細(xì)胞Notch通路信號(hào)分子基因表達(dá)的影響觀察口服給予LW及SB、SX對(duì)Notch通路信號(hào)分子基因表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，連續(xù)4周口服給予L

16、W(10g/kg)及SB(6.4g/kg)、SX(3.6g/kg)，對(duì)SAMP8胸腺淋巴細(xì)胞Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的四種信號(hào)分子的基因表達(dá)具有不同的作用。LW、SB及SX對(duì)Notch1和PS1基因表達(dá)水平無(wú)明顯影響，但可不同程度地降低PS2和HES1基因的表達(dá)水平，其中以LW的作用最強(qiáng)。 以上結(jié)果表明，LW使正常小鼠胸腺CD8+細(xì)胞的比例明顯增高，CD4+/CD8+比值明顯降低，但其卻使SAMP8胸腺CD8+細(xì)胞比例明顯降低，

17、CD4+/CD8+比值增高，SB對(duì)SAMP8的影響與LW相似，表明LW對(duì)正常小鼠和SAMP8胸腺淋巴細(xì)胞亞群的分化具有不同的的作用。在對(duì)胸腺淋巴細(xì)胞Notch通路信號(hào)分子基因表達(dá)的影響上，LW使正常小鼠的PS2和HES1基因表達(dá)水平明顯增高，但LW、SB及SX則使SAMP8的PS2和HES1基因表達(dá)水平明顯降低，表明LW及其SB、SX拆方對(duì)正常小鼠和SAMP8胸腺淋巴細(xì)胞的Notch通路信號(hào)分子基因的表達(dá)也具有不同的影響，但分別與對(duì)胸腺