miRNA對共刺激分子CD80、CD86及其受體在消化道腫瘤中表達的調控作用及臨床意義.pdf

1、前言
　　活化的T淋巴細胞在機體的抗腫瘤、抗感染和自身免疫疾病中發(fā)揮重要作用。T細胞的活化不僅需要T細胞受體（TCR）與抗原肽-MHC復合物作用產生的第一信號，還需要表達于抗原提呈細胞（APC）表面的B7家族協同刺激分子與T細胞上的相應受體結合產生的第二信號。協同刺激分子與其受體結合產生正性或負性信號。協同刺激分子CD80和CD86與其受體CD28結合產生正性信號，或與其受體CTLA-4結合提供負性信號，調節(jié)T細胞活性，進而調控機

2、體的免疫反應。協同刺激分子CD80和CD86表達在APC細胞上，而在多數的腫瘤組織及細胞中低表達或不表達，從而不能有效的誘導 T細胞的活化，引起腫瘤細胞免疫逃逸而促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。通過結直腸癌小鼠模型發(fā)現，腫瘤細胞低表達CD80分子的是其逃避免疫監(jiān)視的機制，并且這與低表達CD80分子的未成熟的DC細胞的作用機制相似。microRNA（miRNA）是一類長約22個核苷酸的內源性非編碼小分子RNA，通過與靶mRNA的3'-UTR互補結合

3、，在轉錄后水平調控基因翻譯，在基因表達中發(fā)揮著重要的作用。目前多數的研究發(fā)現腫瘤中異常表達的miRNA可以調節(jié)細胞的分化、增殖以及凋亡從而影響腫瘤微環(huán)境。
　　第一部分人結直腸癌中異常表達的miRNA對CD80、CD86及其受體分子表達的調控作用
　　【目的】探討在結直腸癌中異常表達的 miRNA對 CD80、CD86及其受體分子表達的調控作用。
　　【方法】首先采用實時熒光定量PCR法測定6例結直腸癌中CD80、CD

4、86的表達量，并對其進行分析。然后，采用miRNA芯片技術測定6例結直腸癌組織及癌旁組織中 miRNA的表達量，統(tǒng)計分析癌組織中異常表達的 miRNA。在這些miRNA中，使用生物信息學軟件預測可能與CD80、CD86及受體CD28、CTLA-4基因3?-UTR作用的miRNA；并用實時熒光定量PCR的方法進一步驗證預測有作用的miRNA在結直腸癌組織中的表達。最后，采用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)分析這些miRNA對CD80、CD86及受體

5、CD28、CTLA-4基因表達的調控作用。
　　【結果】（1）實時熒光定量PCR結果顯示CD80、CD86的mRNA水平在結直腸癌及癌旁的表達量沒有明顯差異。（2）結直腸癌組織中有30條miRNA表達明顯高于癌旁組織，有8條miRNA的表達明顯低于癌旁組織；其中上調的miR-21、miR-34a可能與CD80基因3?-UTR結合，miR-21、miR-31、miR-34a和miR-181b可能與CD86基因3?-UTR結合，miR

6、-31、miR-34a、miR-181b、miR-20b和miR-142-3p可能與CD28基因3?-UTR結合；表達下調的miR-140-3p、miR-143、miR-145和miR-378可能與 CTLA-4基因3?-UTR結合。（3）構建了含 CD80、CD86與受體CD28、CTLA-4基因3?-UTR的熒光素酶重組載體，通過酶切和基因測序的方法驗證正確。雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)分析結果發(fā)現，上調表達的 miR-21、miR-31

7、、miR-20b和miR-142-3p可以分別與CD80、CD86和CD28基因3?-UTR結合，而下調表達的miR-378和miR-145可以與CTLA-4基因3?-UTR結合，抑制其表達。
　　【結論】結直腸癌組織中，miR-21、miR-31、miR-20b和miR-142-3p等miRNA表達上調，抑制了CD80、CD86和CD28的蛋白表達；而下調表達的miR-378和miR-145可以抑制CTLA-4的蛋白表達，從而介

8、導了腫瘤免疫逃逸。這為研究腫瘤細胞免疫逃逸和尋找到新的抗腫瘤靶標奠定了基礎。
　　第二部分 CD80基因3?-UTR內的單核苷酸多態(tài)性與胃癌發(fā)生的相關性研究
　　【目的】研究CD80基因3?-UTR內的單核苷酸多態(tài)性（SNP）與胃癌發(fā)生的相關性。
　　【方法】收集了183例胃癌患者以及348例正常人的外周血樣本。首先，運用生物信息學方法篩選出位于CD80基因3?-UTR的SNP位點；然后預測CD80基因3?-UTR內可

9、能存在的miRNA結合位點；最后，篩選出位于預測的miRNA結合位點內的，且較小等位基因頻率(MAF)大于10%的SNP進行研究。采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度分析法（PCR-RFLP）檢測了樣本中CD80基因3?-UTR內的單核苷酸多態(tài)性基因型分布，并統(tǒng)計分析基因型與胃癌發(fā)生及患者病理參數的相關性。
　　【結果】（1）CD80基因3?-UTR上存在21個SNP位點，MAF大于10%的SNP有rs1599795、rs15997

10、96、rs17281703、rs57271503和rs7628626，其中rs1599795位于3條預測的miRNA的結合位點內，因此選取該SNP位點進行研究。（2）統(tǒng)計分析發(fā)現，與TT型純合子相比，TA型雜合子患胃癌的危險性更高（OR=1.44，95% CI=0.98-2.11），并且A等位基因攜帶者患胃癌的風險性顯著高于TT純合子（P=0.036）。（3）SNP rs1599795基因型與胃癌的腫瘤面積、腫瘤發(fā)生位置、腫瘤浸潤深度、

11、淋巴結轉移、遠端轉移和TNM分期等參數之間存在顯著的相關性。
　　【結論】CD80基因3?-UTR上的SNP位點rs1599795與胃癌發(fā)生的風險性相關，該SNP基因型與多種胃癌病理參數的相關，提示其可能參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。這些研究結果為闡明CD80在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮的重要作用奠定了基礎。
　　小結
　　本論文主要探討了結直腸癌中異常表達的 miRNA對協同刺激分子 CD80、CD86及其受體分子CD28和CT

12、LA-4表達的調控機制。研究發(fā)現，人結直腸癌組織中miR-21、miR-31、miR-20b和miR-142-3p表達顯著升高，分別與CD80、CD86和CD28基因的3?-UTR結合，而miR-378和miR-145表達下調，可以與CTLA-4基因的3?-UTR結合，抑制其表達，參與腫瘤免疫逃逸。此外，研究發(fā)現CD80基因3?-UTR內的SNP位點rs1599795與胃癌發(fā)生的風險性相關，并與胃癌的腫瘤面積、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移等