從中醫(yī)“圓道”理論探討模擬微重力對骨髓間充質干細胞形態(tài)及功能的影響.pdf

1、骨髓間充質干細胞(Bonemarrowmesenchymalstemcell,BMSCs)因其自身的優(yōu)點被認為是不久即將被引入臨床治療的最優(yōu)干細胞,其研究從屬于前景開闊的再生醫(yī)學領域,目前世界上有越來越多的學者投身到干細胞的研究中來,然而干細胞在臨床運用的低效率與高風險是制約其廣泛運用于臨床的瓶頸,如何能從干細胞本身著手提高干細胞的分化潛能使其高效安全的運用于臨床是擺在研究者面前的難題。
　　近年來,隨著航空航天事業(yè)的迅猛發(fā)展,諸

2、多研究人員將研究手段發(fā)展到太空領域,并逐步認識到微重力會對生物體的生理功能產生巨大的影響。微重力在細胞水平的作用也已引起了研究者的廣泛關注。研究表明諸多細胞在模擬微重力環(huán)境(simulatedmicrogravity,SMG)下可以呈現一種圓形改變,《內經》云“蓋有諸內者,必形諸外”,細胞這種形態(tài)的改變必然會對其功能行為產生巨大的影響,在中醫(yī)圓道理論的指導下,我們推測模擬微重力為骨髓間充質干細胞提供一種平衡、圓融的環(huán)境,這種環(huán)境更有利于

3、干細胞保持其自身的特性。為了證明此種推測,本實驗研究模擬微重力干預對骨髓間充質干細胞形態(tài)及增殖、分化、遷移等能力的影響,從而從干細胞本身著手,為臨床獲得高質量、高誘導效率干細胞提供新的手段,本研究首次以“圓道”理論為指導提出模擬微重力處理這一促進干細胞增殖、分化的新手段,為干細胞早日應用于臨床提供新的思路。
　　實驗一模擬微重力對BMSCs形態(tài)的影響
　　1.目的
　　研究SMG干預對BMSCs形態(tài)及細胞骨架的影響。<

4、br>　　2.方法
　　BMSCs體外原代分離培養(yǎng)后,流式細胞術進行表面抗原鑒定,再將BMSCs隨機分為正常重力(NG)對照組與模擬微重力(SMG)48h、72h和120h組,光學顯微鏡下觀察各組BMSCs形態(tài)的改變,熒光染色觀察各組細胞骨架蛋白F-actin的變化。
　　3.結果
　　流式分析結果顯示原代培養(yǎng)的BMSCs表達CD44、CD90陽性(陽性率分別為94.74％和93.57%),表達CD34和CD45陰性。

5、光學顯微鏡下可見細胞在SMG干預后形態(tài)變圓,隨著SMG處理時間的延長,細胞的寬/長比值越接近1,這種形態(tài)的圓形改變在SMG刺激72h時最明顯,微重力處理時間延長至120h與SMG72h相比較,形態(tài)的改變沒有統(tǒng)計學意義。鬼筆環(huán)肽染色發(fā)現短時間的SMG干預可使細胞骨架張力下降,細胞骨架彌散,使細胞形態(tài)呈現圓形改變,隨著微重力處理時間的延長,細胞骨架有重組跡象。
　　4.結論
　　BMSCs在SMG干預后可以呈現形態(tài)的“歸圓”改變

6、,這種形態(tài)的改變是通過SMG調整細胞骨架實現的。
　　實驗二模擬微重力對BMSCs功能的影響
　　1.目的
　　研究SMG干預后形態(tài)改變的BMSCs增殖、凋亡、多潛能分化能力和遷移能力的變化。
　　2.方法
　　將三代骨髓間充質干細胞隨機分為NG組和SMG組(72h),研究:
　　2.1.增殖能力:①BrdU標記法檢測兩組細胞BrdU陽性率。②兩組細胞在培養(yǎng)0、3、7天后,對細胞進行計數繪制細胞生長曲

7、線,觀察細胞增殖情況。③流式細胞術檢測兩組細胞的凋亡率。
　　2.2.多潛能分化能力:①QuantitativePCR及WesternBlotting檢測干細胞多潛能標志OCT4的表達。②將兩組細胞在正常重力下分別進行內皮方向的誘導分化后,免疫熒光染色及WesternBlotting檢測兩組細胞VWF及CD31的表達;脂肪方向的誘導分化后,光鏡下觀察油紅O染色陽性表達率,WesternBlotting檢測PPARγ2在各組細胞蛋白

8、水平的表達情況;神經方向的誘導分化后,免疫熒光染色及WesternBlotting檢測兩組細胞MAP2及NF-H的表達情況。③隨后研究BMSCs在SMG環(huán)境中誘導分化能力的變化:將BMSCs在SMG條件下培養(yǎng)72h后,在SMG環(huán)境中分別進行脂肪方向和神經方向誘導后,重新檢測上述相關指標的變化。
　　2.3.遷移能力:①細胞劃痕實驗測定兩組細胞劃痕后0h、24h、48h、72h劃痕的寬度。②WesternBlotting檢測兩組細胞

9、CXCR4的表達情況。
　　3.結果
　　3.1.增殖能力:①SMG組細胞BrdU陽性率較對照組增高(P<0.05)。②BMSCs生長曲線顯示,在培養(yǎng)第3天和第7天時,SMG組細胞數量均較NG組增多。③流式細胞術顯示不同SMG組BMSCs與NG組BMSCs凋亡率無顯著差異。
　　3.2.多潛能分化能力:①QuantitativePCR和WesternBlotting結果表明OCT4在SMG組細胞中表達上調,SMG72h

10、組升高最明顯。②在正常重力下內皮方向的誘導結果表明:SMG組細胞VWF和CD31的表達量均較NG組增高。脂肪方向誘導結果表明:SMG組油紅O染色陽性表達率(47%)明顯高于NG組(18%),WesternBlotting結果顯示PPARγ2在SMG組的表達較NG組上調具有統(tǒng)計學意義。神經方向誘導結果表明:SMG組細胞MAP2和NF-H的表達量上調較NG組均具有統(tǒng)計學意義。③BMSCs在SMG環(huán)境中誘導分化能力的變化:兩組BMSCs在正常

11、重力條件下誘導后,OCT4僅有微量表達,而細胞在SMG環(huán)境中脂肪方向誘導后,細胞油紅O染色陽性率極低(2%)且PPARγ2的表達量極少,但OCT4表達較前兩組升高(P<0.05)。SMG環(huán)境中神經方向誘導后細胞MAP2及NF-H的表達量極少,但OCT4表達增多。
　　3.3.遷移能力:①細胞劃痕實驗顯示與NG組相比,SMG組在劃痕0h、24h、48h、72h后細胞劃痕距離差異無統(tǒng)計學意義。WesternBlotting結果分析,兩