苦參堿促進腫瘤細胞凋亡及其機制的實驗研究.pdf

1、目的：當前惡性腫瘤的發(fā)病率逐年增加，已經(jīng)成為嚴重威脅人類健康的一大殺手，對惡性腫瘤的防治成為醫(yī)務工作者面臨的重要課題。越來越多的研究表明腫瘤發(fā)生不僅是由于瘤細胞的過度增生，還因為瘤細胞死亡過少，凋亡機制障礙。細胞凋亡參與腫瘤起始過程，并對腫瘤發(fā)生發(fā)展起負調控作用。本研究運用多種實驗技術，探討苦參堿(matrine)對人卵巢癌細胞A21-2和人骨肉瘤細胞MG63的增殖抑制和誘導凋亡效應，并對促凋亡因子caspase-3進行進行檢測和分析，

2、以期進一步闡明苦參堿抗癌的作用機制，為苦參堿的抗癌治療提供實驗基礎。 方法：將A21-2細胞和MG63細胞置于37℃，飽和濕度5％的CO2培養(yǎng)箱常規(guī)條件下培養(yǎng)，待細胞進入對數(shù)生長期后用于實驗。 1.應用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化：將不同濃度的苦參堿作用于A21-2細胞和MG63細胞，在倒置相差顯微鏡下定時觀察細胞的生長情況并照相。 2.透射電子顯微鏡觀察：0.6mg/ml的苦參堿作用A21-2細胞和MG63

3、細胞72h后收集細胞，體積分數(shù)為2.5％戊二醛4℃固定，用10g/L鋨酸后固定，丙酮系列脫水，最后用Epon812環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機切片，醋酸鈾與檸檬酸鉛雙重染色，電鏡下觀察并照相。 3.采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測藥物對細胞的生長抑制作用。 4 流式細胞術(FCM)檢測細胞凋亡、細胞周期分布：收集經(jīng)苦參堿作用72h的A21-2細胞和MG63細胞及對照組細胞，冷PBS漂洗，預冷70％乙醇，4℃固定，上機檢測前

4、離心去固定液，0.5％胃蛋白酶消化，碘化丙錠(PropidiumIodide，PI:50mg/L Trinton X-100 1.0％)室溫避光染色。流式細胞儀上機檢測，應用軟件進行分析。 5 FCM檢測Caspase-3蛋白的表達：收集經(jīng)苦參堿作用72h的A21-2細胞和MG63細胞及對照組細胞，按常規(guī)方法進行熒光標記，流式細胞儀檢測熒光強度，以熒光指數(shù)(FI)表示蛋白的表達情況。 6 反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR

5、)檢測Caspase-3mRNA的表達：利用TRIZOL試劑盒提取經(jīng)苦參堿作用72h后的A21-2細胞、MG63細胞及對照組細胞RNA，反轉錄、擴增后得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)8％聚丙烯酰氨凝膠電泳，溴化乙錠(EB)顯色，Bio-profif凝膠圖像分析系統(tǒng)進行攝像分析。 結果：(1)經(jīng)0.2、0.4、0.6mg/ml苦參堿處理A21-2細胞和MG63細胞72h后，倒置相差顯微鏡下觀察，與對照組相比，用藥組的細胞生長明顯被抑制，胞漿內顆

6、粒增多增粗，部分細胞變圓而懸浮在培養(yǎng)基內。透射電鏡下觀察到染色體凝集邊聚，粗面內質網(wǎng)腫脹，細胞表面出現(xiàn)空泡。(2)分別用苦參堿(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml)作用于A21-2細胞和MG63細胞48、72h，MTT結果顯示苦參堿能明顯抑制A21-2細胞和MG63細胞的增殖，并呈劑量和時間依賴性。作用48h和72h后，A21-2細胞半數(shù)抑制率(inhibitoryconcentration giving 50％ inhi

7、bition，It50)分別為1.017mg/ml、0.751 mg/ml，MG63細胞半數(shù)抑制率(inhibitoryconcentration giving 50％ inhibition，IC50)分別為1.019mg/ml與0.701mg/ml。1.0mg/ml苦參堿作用A21-2細胞和MG63細胞72h后抑制率可分別達到71.89％、71.16％(p<0.01)。(3)FCM分析發(fā)現(xiàn)，0.2、0.4、0.6 mg/ml的苦參堿處

8、理細胞72h后，G0/G1期前面出現(xiàn)凋亡峰。A21-2細胞凋亡率分別為13.54％±0.39％、17.93％±0.19％、26.35％±0.11％，細胞G0/G1期比例由對照組54.12％±1.23％升至59.35％±1.31％，67.52％±0.42％，77.53％±0.19％，S期、G2/M期細胞比例減少，MG63細胞凋亡率分別為11.37％±0.53％、14.28％±0.16％、24.13％±0.23％(p<0.01)，處理后的細

9、胞G0/G1期比例增高(由對照組63.21％±1.52％升至69.14％±1.12％，75.31％±0.33％，82.64％±0.16％)。caspase-3蛋白表達升高，A21-2細胞的熒光指數(shù)分別為1.60±0.03、1.78±0.02、2.08±0.05，MG63細胞的熒光指數(shù)分別為1.64±0.01、1.84±0.03、2.08±0.02。(4)RT-PCR結果表明：經(jīng)0.2、0.4、0.6 mg/ml的苦參堿處理A21-2細胞