新型促紅素衍生肽對小鼠腎缺血再灌注損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、目的：在小鼠腎臟缺血再灌注(Ischemia Reperfusion，I/R)損傷模型中探究新型促紅細胞生成素B螺旋表面肽(Helix B surface peptide，HBSP)對腎功能及組織結構的保護作用，并明確組織保護性β共同受體(Beta Common Receptor，βcR)亞單位在腎臟局部的表達分布及其在缺血再灌注損傷中的變化，進一步探討HBSP對凋亡通路蛋白caspase-9及caspase-3活化的影響，并研究細胞內

2、抗凋亡信號通路PI3K/Akt在其中的作用，闡明HBSP的腎臟保護機制，為其臨床轉化提供理論依據。
　　 方法：選擇20-25g雄性BALB/c小鼠24只，隨機分為I/R組6只(I/R)，HBSP組6只(HBSP)，HBSP+Wortamannin組6只(H+W，wortmannin為PI3K通路抑制劑)，假手術組6只(sham)。建立雙側腎蒂夾閉30min模型，假手術組僅游離雙側。腎蒂而不行結扎。根據參考文獻，HBSP組于手術

3、后1min、6h、12h給予腹腔注射HBSP，劑量8nmol/kg，H+W組于術前30min腹腔注射wortmannin，劑量1mg/kg，I/R組及sham組均腹腔給予等量生理鹽水。各組于缺血再灌注后48h取心臟血測腎功能指標(血肌酐、尿素氮)，同時取腎臟標本制作石蠟切片行HE及TUNEL染色，進一步觀察組織病理改變及調亡水平。應用免疫組化技術分別檢測I/R組及sham組腎臟受體亞單位βcR和促紅素受體亞單位(erythropoiet

4、in receptor，EPOR)的分布及表達情況，并應用免疫共沉淀技術進一步檢測各組腎組織中功能性βcR/EPOR異二聚體的表達水平。應用western blot檢測各實驗組及wortmannin組小鼠腎組織中PI3K p85、總Akt以及磷酸化Akt的表達水平。應用免疫組化檢測各組腎組織切片中活化型caspase-3陽性細胞數(shù)量，并進一步應用western blot檢測各組腎組織中49kD全長型caspase-9、37/39kD活化

5、型capsase-9及17kD活化型caspase-3的表達水平。
　　 結果：HBSP組術后血肌酐和尿素氮水平顯著低于I/R組(23.83±1.32 vs。119.80±6.41μmol/L，P<0.01；10.62±0.79 vs.50.33±5.09mmol/L，P<0.01)。光鏡下HE染色切片可見HBSP組腎臟損傷程度與I/R組相比明顯減輕，小球結構基本清楚，小管上皮細胞輕度水腫，基底膜較完整，小管內少量管型，腎小管損

6、傷病理評分明顯降低(1.17±0.31 vs.4.50±0.43，p<0.01)。TUNEL染色可見HBSP組凋亡陽性細胞明顯少于I/R組，半定量結果有統(tǒng)計學差異(3.83±1.40 vs。24.17±1.45，p<0.05)。組織保護受體的亞單位βcR和EPOR主要組成性表達于腎小管上皮細胞，并在缺血再灌注損傷后明顯上調(94.83±4.19 vs。130.70±13.80，p<0.05；184.30±6.97 vs.246.5±15

7、.43，p<0.01)，進一步探究發(fā)現(xiàn)βcR/EPOR異二聚受體在腎組織中組成性表達，且缺血再灌注損傷對其亦有顯著的刺激作用(與EPOR共沉淀的βcR/GAPDH，0.47±0.12 vs.0.95±0.12，p<0.05)。實驗組腎組織中PI3K p85表達水平無明顯差異。HBSP組腎臟中總Akt表達水平以及磷酸化蛋白p-Akt-ser473和p-Akt-th308表達水平均較I/R組明顯升高(/β-actin，0.44±0.042

8、vs.0.21±0.04，p<0.05；2.09±0.55 vs.0.13±0.01，p<0.05；0.77±0.12 vs.0.12±0.06，p<0.01)。wortmannin對PI3K/Akt通路蛋白表達，包括PI3K p85、Akt及其磷酸化蛋白具有普遍的抑制作用(/β-actin，0.07±0.04 vs。0.44±0.04，p<0.05；0.05±0.01 vs.2.09±0.55，p<0.05；0.01±0.00 vs.

9、0.77±0.12，p<0.01)。HBSP組腎臟中caspase-3陽性細胞數(shù)量明顯少于I/R組(1.33±0.42 vs。8.67±0.67，p<0.01)，而PI3K/Akt通路抑制劑wortmannin能明顯逆轉HBSP的作用(15.67±1.98 vs.1.33±0.42，p<0.01)。各組腎組織中49kD全長型Caspase-9表達無統(tǒng)計學差異，而HBSP組39kD、37kD活化型片段及caspase-3的17kD活化型片

10、段均較IR組顯著降低(/β-actin，0.60±0.07 vs.1.55±0.32，p<0.05；0.05±0.01 vs.0.89±0.31，p<0.05；0.08±0.03 vs.0.26±0.04，p<0.05)，wortmannin亦明顯逆轉HBSP對上述caspase-9及caspase-3活化片段的抑制作用(/β-actin，2.95±0.58 vs.0.60±0.07，p<0.05；2.01±0.17 vs.0.05±0

11、.01，p<0.01；1.85±0.62 vs.0.08±0.03，p<0.05)。
　　 結論：新型促紅細胞生成素衍生肽HBSP能顯著減輕腎臟缺血再灌注損傷后腎小管上皮細胞損傷程度和凋亡水平，具有良好的腎臟保護作用。組織保護性受體βcR/EPOR組成性表達于腎臟中，并在缺血再灌注損傷中上調表達，是HBSP腎臟保護作用的基礎。HBSP通過上調細胞內Akt蛋白表達及磷酸化水平，活化PI3K/Akt信號通路，抑制凋亡蛋白caspas